石楠抗寒基因AmGS高效转化体系的研究

本研究以石楠为受体材料,利用农杆菌浸染方法开展沙冬青抗寒基因AmGS转化试验,通过对不同的受体材料浸染部位、菌液浓度、乙酰丁香酮和浸染时间对转化材料的死亡率%、分化率%、分化芽数(个)、芽苗长度(cm)以及芽苗颜色的分析,得出最佳转化方法为:采用茎尖为转化材料,菌液浓度为2/3～1/2原液,浸染时间为10 min,添加乙酰丁香酮浓度为25～30 mg/L.其中浸染部位是影响基因高效转化的最主要因素,菌液浓度、乙酰丁香酮和浸染时间的作用次之,经在50 mg/L浓度的卡那霉素培养基筛选培养,获得一批的抗性植株,经PCR检测获得6株转化株系.     

苦参毛状根诱导及其培养条件的研究

[目的]为药用成分苦参碱及氧化苦参碱的来源提供新途径。[方法]考察了R1601菌株对苦参不同外植体在不同浓度乙酰丁香酮和侵染时间影响下苦参毛状根的诱导率;研究了培养基中的组分和浓度对苦参毛状根继代生长的影响。[结果]以苦参幼芽为外植体,在R1601菌液中添加100μmol/L乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃,MS共培养基上暗培养2 d,苦参毛状根的诱导效果较好,诱导率28.6%,存活率46.7%;苦参毛状根在改良的继代培养基上生长良好。[结论]苦参毛状根的最佳诱导条件:以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/L的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导。     

乙酰丁香酮及共培养基pH对棉花遗传转化的影响

以陆地棉种质系珂字棉312为材料,探讨了在共培养基添加乙酰丁香酮(AS)同时调节pH值对抗性愈伤组织诱导率、正常体细胞胚数以及Kan抗性苗获得率的影响.结果表明,在共培养阶段的乙酰丁香酮浓度与pH均对棉花遗传转化有明显的影响.当乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L、pH值为5.6时,棉花的遗传转化率最高.其抗性愈伤组织的诱导率达到72.96％,Kan 抗性苗获得率可达到8.96％;对转化再生植株进行PCR检测,约52.07％的Kan抗性苗呈阳性.     

农杆菌介导台农17号菠萝遗传转化相关因素优化

为建立稳定的农杆菌介导的菠萝遗传转化体系,以台农17号菠萝幼嫩愈伤组织为试验材料,以GUS基因瞬时表达率为遗传转化效果评价指标,应用单因素试验法,研究了卡那霉素对台农17号菠萝愈伤组织不定芽分化的影响以及不同菌株、菌液浓度、共培养时间和乙酰丁香酮的添加等转化相关因素对菠萝遗传转化的影响.结果表明,80mg/L卡那霉素浓度可完全抑制不定芽分化,农杆菌菌株采用LBA4404,菌液浓度OD600为0.8,共培养4d时遗传转化效果最佳,GUS基因瞬时表达率达到39.44％,而菌液中添加乙酰丁香酮未明显提高GUS基因瞬时表达率.研究初步建立了农杆菌介导的台农17号菠萝遗传转化体系,为开展菠萝关键基因功能验证和品种改良搭建了遗传转化平台.     

农杆菌介导的白杨遗传优化体系研究

以杂种白杨353为研究材料,利用农杆菌介导法转化p AB5启动子诱导外源基因删除系统,采用正交实验设计,以叶盘分化率为评价指标,优化转化过程中主要影响因子。结果表明:优化体系为菌液OD600值0.8,侵染时间8 min,乙酰丁香酮浓度200μmol/L,分化培养基中卡那霉素浓度35 mg/L,头孢霉素浓度350 mg/L,抗性芽生根时的筛选卡那霉素选择压25 mg/L。采用上述遗传优化体系,杂种白杨353叶盘分化率达80.00%,抗性植株经PCR检测,初步确认pAB5启动子诱导的外源基因删除系统已转入其基因组中,为检测外源基因删除系统在杨树中的有效性提供了参考依据。     

‘蜂蜜罐’枣遗传转化条件的优化及Bt基因的导入

为建立‘蜂蜜罐’枣高效遗传转化体系,以‘蜂蜜罐’枣胚培苗上胚轴和子叶为外植体进行转化,研究了不同菌液浓度、侵染时间、共培养时间、AS(乙酰丁香酮)浓度和侵染方式对gus(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因瞬时表达率的影响。结果表明,当菌液OD_(600)值为0.5,真空辅助侵染10 min,共培养3 d,上胚轴和子叶外植体的共培养培养基中分别添加20和10 mg·L~(-1)乙酰丁香酮时,其gus瞬时表达率均最高,为最佳遗传转化体系。利用已优化的遗传转化体系进行Bt基因转化,共获得24个PCR(聚合酶链式反应)检测呈阳性的再生芽;对PCR检测呈阳性的不定芽进行伸长培养和不定根诱导,最终获得完整转基因植株。本研究初步获得了转Bt(苏云金芽孢杆菌)基因的枣植株,为通过转基因手段进行枣抗虫新种质选育提供可能。     

山新杨转Bt+蜘蛛杀虫肽基因的分析

以山新杨(Populus davidiana Dode × P.bollena Lauche)为受体材料,在筛选遗传转化条件的基础上,利用农杆菌介导叶盘转化法进行了Bt+蜘蛛杀虫肽基因转化研究.结果表明:在叶片转化时,卡那霉素的临界质量浓度为10 mg/L;生根筛选培养时卡那霉素的临界质量浓度为15 mg/L;利用质量浓度为600 mg/L的头孢噻肟钠脱菌,对叶片生长和不定芽形成影响不大.山新杨遗传转化的工程菌菌液浓度以0.1～0.2(OD600)为最佳,其叶片分化率为73%～77%、抗性芽率为20%～23%;浸染时间以2～5 min为宜,其叶片分化率和抗性芽率最高.在共培养基中加入200 μmol/L的乙酰丁香酮,其叶片分化率和抗性芽率分别比对照提高1.43倍和2.61倍.对转化植株的PCR检测结果呈阳性,初步证明外源基因Bt+蜘蛛杀虫肽导入并整合进了山新杨基因组.     

提高黄瓜农杆菌遗传转化体系再生频率的研究

以黄瓜子叶为外植体,经农杆菌介导转化导入抗除草剂基因。在共培养的菌液中添加乙酰丁香酮,可以明显提高外植体的愈伤组织诱导率;延长农杆菌与外植体的共浸染时间至40min,外植体的存活率达90.5%,出芽率可达38.1%。     

拟青山海关杨高效遗传转化系统的建立

为建立拟青山海关杨的再生和高效遗传转化系统,以该杨树叶片为外植体,研究了适合叶片再生的最适培养基;并利用GUS瞬时表达法,研究了菌种、预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮(AS)浓度5个因素对拟青山海关杨叶片遗传转化的影响。结果表明,拟青山海关杨叶片最适不定芽诱导培养基为MS添加0.5mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA,叶片再生频率为95%,平均不定芽数为10.07个;该杨树的高效遗传转化体系为:叶片无预培养,菌种使用GV3101,侵染液OD600为0.4～0.6,侵染10min,共培养培养基中添加乙酰丁香酮200μmol/L,在此条件下,GUS荧光定量分析结果显示叶片的GUS活性达到最大值。     

84 K杨再生和遗传转化体系的优化

为了优化84 K杨的再生和遗传转化体系,以84 K杨树叶片为外植体,采用正交试验研究了不同培养基和激素配比对芽和芽苗生根的影响,并从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性苗频率为衡量指标,研究了各因素对84 K杨遗传转化率的影响。结果表明,84 K杨叶片最适的芽诱导培养基及激素配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L,芽苗最适诱导生根培养基及激素配比为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.05 mg/L;优化筛选的最适转化体系为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5 min,共培养4 d。采用上述优化的再生和遗传转化体系,84 K杨每片叶平均生芽数可达20个,芽苗生根率可达99%,生根数为6条,叶盘转化率可达35%。     

欧洲大樱桃的组织培养与快速繁殖

以欧洲大樱桃幼嫩茎段为外植体材料,研究了不同浓度6-BA和IAA外源激素配比组合和不同培养温度对樱桃茎段离体培养的影响,结果表明:在附加6-BA 1.5 mg/LI、AA 0.3 mg/L的MS培养基上茎段外植体生长健壮,芽分化数和诱导率较高,为茎段初代培养的最适培养基。温度对茎段组织培养再生不定芽也有一定的影响。在培养温度为先15℃、后25℃的条件下,茎段外植体芽分化数为7.4个,芽诱导率为99%。这表明经低温15℃条件下处理的外植体比其他温度条件更能诱导芽分化。     

番茄下胚轴和子叶离体诱导成株的激素调控

以番茄幼苗的下胚轴和子叶为外植体,研究不同激素培养基对其不定芽诱导、增殖及生根的影响。结果表明,诱导不定芽的最适培养基为MS＋6-BA（2.0 mg/L）＋IAA（0.3 mg/L）,该培养基中下胚轴的不定芽诱导率为73.3%,子叶的不定芽诱导率为53.2%;低浓度IBA和IAA配合使用的生根效果好于单独使用IBA。     

文心兰切花品种组织培养快速繁殖技术研究

以新选育的文心兰切花品种的侧芽为外植体,探讨不同灭菌剂、外植体采样时间与季节对侧芽培养的效果以及含不同激素或有机复合物的培养基对原球茎的诱导与增殖、壮苗与生根的影响。结果表明,采用0．1％升汞与10％次氯酸钠组合对外植体的灭菌效果最好,能明显提高外植体的成活率;晴天上午11时或下午16时左右最适合采集外植体,外植体成活率达70％以上;夏、秋两季适宜于外植体的采集,并利于进行灭菌处理和原球茎的诱导与增殖。适宜于原球茎和丛芽增殖的培养基为MS＋6-BA3．0mg／L＋NAA0．3mg／L;在增殖阶段,MS培养基中添加10％（W/V）椰子水有利于丛芽增殖,而10%（W/V）香蕉浆有利于原球茎增殖。在壮苗阶段,MS培养基添加10％（W/V）香蕉浆对壮苗效果最好,原球茎转化率高,小苗生长健壮;在生根阶段,以1／2MS＋NAA0．5mg／L＋10％（W／V）香蕉浆的生根效果最佳,生根率达100％,且小苗生长健壮,移栽成活率达90％以上。     

不同牡丹外植体诱导愈伤组织的研究

用牡丹的土芽、叶柄、叶片、幼芽等外植体进行愈伤组织的诱导。结果表明,配方MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L的培养效果最为理想。不同外植体中,幼芽和土芽诱导率最高,叶柄和叶片次之,其诱导率分别为100.0%、60.0%、26.6%。     

木薯外植体表面灭菌与增殖培养的研究

[目的]筛选出适合木薯组织培养的灭菌体系,为加快木薯组织快繁提供科学依据。[方法]以木薯品种GR891的腋芽为外植体,研究经甲基托布津杀菌剂处理和无处理外植体分别采用不同组合、不同处理时间对其表面灭菌的效果,同时研究6-BA和6-BA与NAA组合对丛芽诱导培养效果的影响。[结果]经甲基托布津杀菌剂处理后用体积分数75%乙醇消毒10 s＋质量分数0.1%升汞处理8 min效果最好,外植体存活率为61.3%;以MS＋6-BA 1.5 mg/L＋糖30 g/L＋琼脂6.5 g/L培养基诱导培养芽效果最好,有的丛芽能达到7～9株,丛芽生长速度快,健壮。[结论]建立了木薯GR891组织培养外植体灭菌与增殖培养体系。     

蚕豆组织培养再生植株的研究

[目的]研究不同外植体、培养基、基因型及放置方式对蚕豆不定芽诱导效果和植株再生的影响。[方法]以蚕豆幼胚、未成熟子叶、成熟子叶、成熟子叶节为材料,通过诱导不定芽→分成单个小植株→诱导生根这一过程检测不同外植体、培养基、基因型、放置方式对不定芽诱导及植株再生的影响。[结果]所试4种外植体中,以成熟子叶节芽诱导频率最高,可达95%;不同外植体所需要的适宜培养基不同;不同基因型对蚕豆子叶节诱导芽效果差异很大;子叶节垂直半埋于培养基比平置于培养基时,其芽诱导效率高,且不定芽在IBA浓度为120mg/L的MS培养基上诱导生根,长成完整小植株。[结论]该研究建立了蚕豆器官发生再生植株的试验程序,为进一步研究提供试验依据。     

不同因素对番木瓜芽诱导影响的研究

研究了不同因素对番木瓜芽诱导的影响。结果表明：应在春、秋两季晴朗的午后,选取健壮、优良两性株的萌芽条顶芽及以下1-5个芽位作为外植体;外植体先用300 mg/L的利福平预处理1.0 h,再进行常规消毒,然后接种于MS＋BA0.4 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋GA31.0 mg/L＋蔗糖4%的培养基中,在2000 lx的光强下培养20 d后,可获得40%左右的芽诱导率。     

贵州特有爬竹的组织培养研究

以无菌苗率和优良芽率为主要指标,通过对比不同基本培养基和6-BA浓度的试验,以探索爬竹侧芽适宜的消毒方法和诱导培养基。结果表明,爬竹侧芽适宜的消毒方法为:75%酒精处理1 min后再用0.1%升汞处理8～10 min,无菌苗率可达75%左右;采用3/5MS基本培养基时优良芽率最高,显著优于MS、3/4 MS及1/4 MS;在不同激素组合下,6-BA浓度为2 mg/L时优良芽率最高,当6-BA浓度高于2 mg/L时,优良芽率呈显著性减小。     

不同花生品种幼叶丛生芽诱导研究

为筛选高诱导率的花生品种并建立花生的高频再生体系,比较了22个花生品种在MS和1/2MS培养基中的萌发情况,同时以4d苗龄的花生幼叶为外植体,研究了花生幼叶丛生芽诱导率的品种差异性,以及羧苄青霉素(Carb)和头孢霉素(Cef)对花生丛生芽诱导的影响。结果表明:22个花生品种的种子在1/2MS培养基上萌发率均比在MS培养基上稍高。不同品种花生幼叶丛生芽诱导率差异明显,其中Hz006、Hz001、Hz012和Hz037幼叶外植体的丛生芽诱导率较高,均高于90%,Hz015最低,只有31.8%。添加500mg/L Carb对花生幼叶丛生芽分化无抑制作用,其中,Hz009添加500mg/L Carb后,丛生芽诱导率比不添加抗生素的CK提高13.5个百分点;Cef则对多数花生品种芽诱导率具有抑制作用,其中以Hz010最为明显,其丛生芽诱导率下降48.5个百分点。因此,花生种子预培养的适宜培养基为1/2MS,遗传转化时应选择Hz006、Hz001、Hz012和Hz037等高诱导率的花生品种,农杆菌介导花生转化时选择Carb抑菌比较合适。     

红腺忍冬外植体灭菌与芽诱导研究

【目的】探讨影响红腺忍冬外植体消毒灭菌和芽诱导效果的因子,为开发红腺忍冬组培快繁技术提供依据。【方法】以红腺忍冬带腋芽茎段为外植体,按不同灭菌时间（10、12、14、16min）、外植体取材季节（春、夏、秋、冬）、茎段直径大小（O．79、0．51、0．27cm）和处理部位（未木质化、半木质化、完全木质化）分别进行腋芽诱导。【结果】以0．1％升汞加吐温灭菌14min的外植体芽诱导率最高,为41．19％;未木质化茎段的芽诱导率最高,为41．36％;春季和秋季是比较理想的取材季节,外植体的芽诱导率分别为41．61％、39．42％;以平均直径为0．79cm的茎段进行初代培养,芽诱导效果最好,诱导率为41．81％,芽平均高度为2．35cm,平均叶片数为6．06张。【结论】选择未木质化、直径大小为0．79cm左右的茎段,在春季和秋季取外植体,以0．1％升汞加吐温灭菌14min,均可获得较理想的外植体芽诱导效果。