柑橘和拟南芥RIN4基因的过表达载体构建及其对沙田柚的DNA转化

用逆转承-cDNA聚合酶链式扩增(RT-PCR)方法 ,分别从克里曼丁橘和拟南芥中克隆出RIN4基因,连接到表达载体pFGC5941,构建了柑橘CcRIN4和拟南芥AtRIN4基因的过表达载体,并成功转入EHA105农杆菌.通过农杆菌介导法将过表达载体转入沙田柚,获得柑橘和拟南芥RIN4基因的转基因沙田柚植株各6株.     

油菜抗逆基因CBF1植物表达载体的构建及对拟南芥的转化

通过RT-PCR技术从油菜中克隆到抗逆相关基因CBF1,将其成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304,并通过农杆菌采用Floral dip法将重组表达载体转入拟南芥。经潮霉素抗性筛选和PCR检测,初步证明,油菜CBF1基因已经转入到拟南芥中。     

拟南芥的遗传转化

通过构建重组表达载体,转化农杆菌制作浸染液,实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化,将目的基因转入到野生型拟南芥中。通过筛选和鉴定后,得到阳性的转基因植株,最终得到纯合T3代转基因株系。后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定,即可推断目的基因在拟南芥中的功能。     

拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化

采用PCR技术扩增拟南芥PHOT2基因编码序列,并将其转入pSUPER1300超表达载体中,构建了pSUPER1300-PHOT2超表达载体,利用农杆菌介导花序转化法,转入拟南芥野生型gl1、phot1突变体中。PCR扩增及RT-PCR分析表明,该基因超表达,筛选到了潜在的转基因株系。     

拟南芥CBF1基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化

从拟南芥中克隆CBF1基因,转入到植物表达载体pBI121的XbaI和SacI位点,得到中间重组质粒pBI121-CBF1,用EcoRI和HindⅢ将35S启动子与CBF1基因从pBI121-CBF1切下,转入到植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物表达载体p1301-CBF1.将构建的植物表达载体转入农杆菌E...     

采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥

利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体pBI121-tp-crtB转入拟南芥(Arab idopsis thaliana)野生型Columbia中,共获得了14株转基因系,并进行了转基因拟南芥种子萌发实验.结果表明tp-crtB基因已经成功转入拟南芥中,其不影响拟南芥种子的正常萌发.     

海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达载体的构建及拟南芥转化

海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。     

水稻HGO基因启动子的克隆及转化鉴定

HGO是编码酪氨酸降解途径中尿黑酸1,2双加氧酶的基因。探讨了水稻HGO基因的表达特征,构建了水稻HGO基因启动子与GUS表达载体,采用农杆菌介导的浸花法将该表达载体转入拟南芥中,获得转基因植株。通过GUS组织化学染色法检测,发现水稻HGO基因启动子在拟南芥根、下胚轴、叶柄和子叶中高度表达,在真叶中只有叶脉和叶尖上有微弱的表达。     

大豆GmF-box基因植物表达载体的构建及转化拟南芥

为了研究大豆(Glycine max)Gm F-box基因的功能,以含有Gm F-box基因全长c DNA序列的p JET1.2-Gm F-box质粒为模板,通过PCR扩增获得Gm F-box基因的c DNA序列,并将该基因构建到植物表达载体p EGAD中,构建了由Ca MV35S启动子驱动Gm F-box基因的植物表达载体p EGAD-Gm Fbox,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染方法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过除草剂筛选和PCR检测转基因拟南芥,初步证明已获得转大豆Gm F-box基因的拟南芥。     

拟南芥AtSb10基因的克隆及其过表达转基因株系的获得

拟南芥At Sb10基因是一个表达谱和功能都未知的基因,生物信息学分析发现其氨基酸序列含有2个连续的MATH结构域。为分析At Sb10基因的功能,首先,利用RT-PCR方法检测At Sb10基因在拟南芥中的表达模式,结果表明,该基因只在根中表达,而茎、叶片、花与果荚中未检测到;然后克隆了At Sb10基因全长,构建了过量表达载体,通过农杆菌介导法将该载体转入拟南芥Col-0中,获得了10株过表达转基因植株,为进一步研究At Sb10基因的功能奠定了基础。     

胡柚上柑橘衰退病毒的分子检测

胡柚是我国东部地区重要的柑桔栽培品种.近年来,一种以叶片黄化为主要症状的新病害在胡柚种植区暴发流行.通过血清学和分子生物学检测,研究首次从黄化的胡柚叶片中检测到柑橘衰退病毒.系统进化分析表明,分离的CTV CS-7分离物与P09.18、NZRB-TH30等分离物具有较近的进化关系,而与T30等强毒株系有较大的遗传距离,...     

温州蜜柑晚秋光合产物分配与运转的研究

晚秋给两年生未结果温州蜜柑盆栽苗饲喂~(14)CO_2,随后测定不同物候期柑桔苗各器宫的~(14)C同化物的放射性总后度、比活度、~(14)C可溶性成分及氨基酸相对含量.结果表明,在次年新器官生长前,~(14)C同化物主要由叶片向根部运转,~(14)C总活度在根系中的分配达50％以上.从标记后半个月到休眠期,所有器官包括秋叶的放射性比活度增加,唯有春叶比活度明显降低,秋叶却能从春叶中获得养价补充.次年5～11月,新梢生长动用约1/5的14C同化物,同时地上部其他器官的~(14)C分配减少约8.57％,根部减少5.45％,表明新梢生长所需养分主要来自地上部.可溶性~(14)C随年周期进程不断减少.可溶性成分中氨基酸相对含量以新器官和生长期间的器官为高.韧皮部的放射性比活度明显高于木质部,氨基酸含量也以前者为高.     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

【目的】活性氧（reactive oxygen species,ROS）是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘（甜橙）CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析植物激素水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员（CsRboh01—CsRboh07）,其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点（PI）分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域（NADPH_Ox）、铁还原酶跨膜组件（Ferric_reduct）、FAD结合结构域（FAD_binding）和铁还原酶NAD结合结构域（NAD_binding）4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。     

芦柑矮化修剪技术

芦柑进行矮化修剪,可提高芦柑品质、产量,增加经济效益。该文总结了芦柑矮化丰产修剪技术。     

从感染叶片中提取柑橘衰退病毒总核酸3种方法的比较

用分光光度计检测微量抽提法、Trizol法和氯化锂法提取的CTV总核酸,再用RT-PCR和实时RT-PCR法检测,结果表明：3种抽提方法均可以获得CTV的总核酸,其中Trizol法获得的总核酸质量最好,平均浓度为329.3521（μg/mL）,A260/A280平均值为1.8052;进行RT-PCR反应后电泳条带亮度最强;实时RT-PCR显示其Ct值最小.氯化锂法与微量抽提法获得的总核酸质量差异不大,但是微量抽提法更为简便快捷.     

从感染叶片中提取柑橘衰退病毒总核酸3种方法的比较

用分光光度计检测微量抽提法、 Trizol法和氯化锂法提取的CTV总核酸, 再用RT-PCR和实时RT-PCR法检测, 结果表明: 3种抽提方法均可以获得CTV的总核酸, 其中Trizol法获得的总核酸质量最好, 平均浓度为329.352 1(μg/mL), A260/A280平均值为1.805 2; 进行RT-PCR反应后电泳条带亮度最强; 实时RT-PCR显示其Ct值最小. 氯化锂法与微量抽提法获得的总核酸质量差异不大, 但是微量抽提法更为简便快捷.     

日本柑橘黄龙病病原体电镜观察及PCR检测

对日本柑橘黄龙病病原体的形态结构进行了电镜观察，结果发现柑橘黄龙病病菌日本株系绝大多数是球形和短椭圆形，极少观察到棒状形态，直径为100～500nm，外被一层胶状物质包围，厚约10～50nm，这与其他地区发现的柑橘黄龙病病原体形态不同．PCR检测表明，以硅藻土法提取的DNA为模板，利用Ready-To-Go^TM PCR bead法可以得到理想结果。