抗红鳍东方鲀盾纤毛虫药物的筛选及组织分布研究

为筛选出抗红鳍东方鲀盾纤毛虫的天然化合物,并评价其对红鳍东方鲀的安全性,选取了二十种中药有效成分,在光学显微镜下观察统计药物各浓度梯度在10 min、30 min和60 min时对盾纤毛虫的杀灭作用;选择杀虫效果最好的两种药物进行杀虫率检测,通过棋盘法进行联合用药评价;并使用高效液相色谱法研究两种药物在红鳍东方鲀体内的组织分布。结果表明：MNL、NHK两种化合物与盾纤毛虫作用10 min时,药物浓度为8 μg/mL可观察到杀虫作用,药物浓度达到32 μg/mL时杀虫作用显著,随着时间延长杀虫作用增加,但二者联用呈拮抗作用;MNL和NHK在红鳍东方鲀肌肉中达峰时间分别为0.75 h和1 h,在肝脏均呈现双峰现象且第一达峰时间为0.5 h,并分别于3 h和12 h在受检组织中消除。研究表明,即此两种天然化合物具有显著的杀虫作用,在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性,药物吸收快、达峰时间短、消除快,应用中宜单独用药不宜联用。     

抗红鳍东方鲀盾纤毛虫天然化合物筛选及组织分布研究

为筛选出抗红鳍东方鲀盾纤毛虫的天然化合物,并评价其对红鳍东方鲀的安全性,选取了20种中药有效成分,在光学显微镜下观察统计药物各浓度梯度在10、30、60 min时对盾纤毛虫的杀灭作用;选择杀虫效果最好的2种药物进行杀虫率检测,通过棋盘法进行联合用药评价;并使用高效液相色谱法研究2种药物在红鳍东方鲀体内的组织分布。结果表明:MNL、NHK 2种化合物与盾纤毛虫作用10 min时,药物浓度为8μg/mL时可观察到杀虫作用,药物浓度达到32μg/mL时杀虫作用显著,随着时间延长杀虫作用增加,但二者联用呈拮抗作用;MNL和NHK在红鳍东方鲀肌肉中达到峰值时间分别为0.75、1.00 h,在肝脏均呈现双峰现象且达第1个峰值时间为0.5 h,并分别于3、12 h在受检组织中消除。由此表明,2种天然化合物具有显著的杀虫作用,在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性,药物吸收快、达峰时间短、消除快,应用中宜单独用药,不宜联用。     

3种宿主源盾纤毛虫的分离鉴定及体外培养研究

为进一步鉴定和体外培养引起养殖海水鱼类和棘皮动物体表溃烂的致病性盾纤毛虫,分别从辽宁地区养殖的患病刺参Apostichopus japonicus、红鳍东方鲀Takifugu rubripes和大菱鲆Scophthalmus maximus的体表分离出3种盾纤毛虫,采用活体观察、甲醛固定观察、扫描电镜观察、醋酸洋红染色及甲基绿派洛宁染色的方法,对3种盾纤毛虫的形态特征进行分析;采用PCR技术获得其18S rDNA基因序列,并与同源序列进行比对及构建系统发育树;选用L-15、MEM和RPMI1640培养基,在相同培养条件下培养7 d,比较3种盾纤毛虫种群密度的大小;采用盾纤毛虫最适培养基,在不同的温度(10、15、20、30℃)、盐度(13、20、30、40)、pH(4.2、5.2、7.2、9.2)条件下培养7 d,比较3种盾纤毛虫种群密度的大小。结果表明:从刺参和红鳍东方鲀体表分离出的盾纤毛虫形态均与尾丝虫Uronema sp.相似,且18S rDNA序列与尾丝虫的一致性高达99%,在系统发育树上以100%的最高置信度值与尾丝虫聚为一支;从大菱鲆体表分离出的盾纤毛虫形态与伪康纤虫Pseudocohnilembus sp.相似,且18S rDNA序列与伪康纤虫的一致性高达99%,在系统发育树上以100%的最高置信度值与伪康纤虫聚为一支;体外最适培养基筛选结果显示,L-15培养基培养的盾纤毛虫种群密度高于MEM和RPMI1640培养基;体外培养条件试验结果显示,推荐体外培养条件为温度20℃、盐度30、pH 7.2。本研究结果可为海水养殖动物体表溃烂病原盾纤毛虫的分离鉴定及基于盾纤毛虫全虫疫苗研制的体外培养条件优化提供参考。     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1 的氨基酸序列NP_001098599.1 为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST 分析,获得红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的固醇调节元件结合蛋白-1 （Sterol regulatory element bindingprotein-1,SREBP-1）的cDNA 序列及相应的氨基酸序列。采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析。结果发现红鳍东方鲀SREBP-1 基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109 个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1 的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81%、73%、72%、55%、55%、54%和54%;系统进化分析结果表明,红鳍东方鲀SREBP-1 与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1 蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1 个bHLH-zip 的结构。     

红鳍东方鲀IgM重组表达与多克隆抗体制备

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国重要的海水养殖经济鱼类，探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重（H）链恒定（C）区序列，序列大小为1326bp，编码442个氨基酸，将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上，利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白红鳍东方鲀IgM（TrIgM）大小约为62kDa，重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白, 将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠，获得了TrIgM鼠抗血清，Western blot检测结果表明：制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM的重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体，为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。     

红鳍东方鲀生长激素释放激素(GHRH)基因多态性及其与生长性状的关联分析

为研究生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)基因对红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性状的影响,设计4对可覆盖GHRH基因全序列的PCR引物,采用直接测序法对序列进行分析比对以筛选多态位点.试验群体为随机挑选的219尾红鳍东方鲀,于该群体的6月龄及1...     

3个线粒体基因在红鳍东方鲀和暗纹东方鲀中的比较分析

由于形态学无法更精准地鉴别部分红鳍东方鲀和暗纹东方鲀,因此需要通过分子手段鉴别此类无法直观辨认的东方鲀。该研究以15尾红鳍东方鲀和30尾暗纹东方鲀为材料,使用NCBI上红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的线粒体全基因组中3个基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守区域通过Primer 5.0进行引物设计。将45个样品在摸索得到的最适条件下进行扩增并测序,对测序结果进行检验,分析种间差异并进行碱基组成性分析,得出COⅠ上有9个SNPs,COⅡ上有4个SNPs,COⅢ有10个SNPs,使用MEGA-X进行进化树分析得出,该研究所设计的引物可以有效地鉴别2种东方鲀。     

复合微生态制剂在半封闭混养池塘中的应用

在半封闭池塘中混养红鳍东方鲀Fugu rubripes和日本对虾Penaeus japonicus,同时施用复合微生态制剂（每次换水后施用剂量为0.45 g/m3）,对池塘水体中的溶解氧、氨氮、亚硝酸盐氮和化学需氧量进行了监测,并对红鳍东方鲀和日本对虾的成活率和生长情况进行了观察。结果表明：与对照池相比,试验池的溶解氧浓度提高了14.6%,氨氮浓度降低了26.1%,亚硝酸盐氮降低了28.4%,化学需氧量浓度降低了19.8%;与对照池相比,试验池中红鳍东方鲀的体重和成活率分别提高14.3%、6.4%,日本对虾的体长、体重及成活率也分别提高10.3%、15.4%、5.6%。这说明该复合微生态制剂对改善混养池塘水质具有很好的效果,同时对提高红鳍东方鲀和日本对虾的成活率以及促进其生长方面都有很好的作用。     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1的氨基酸序列NP_001098599.1为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST分析,获得红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的固醇调节元件结合蛋白-1 (Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)的cDNA序列及相应的氨基酸序列.采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析.结果发现红鳍东方纯SREBP-1基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81％、73％、72％、55％ 、55％、54％和54％;系统进化分析结果表明,红鳍东方纯SREBP-1与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1个bHLH-zip的结构.     

红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。     

菊黄东方鲀（♀）×红鳍东方鲀（♂）F1代及其亲本肌肉营养成分的比较分析

对菊黄东方鲀Takifugu flavidus(♀)×红鳍东方鲀T.rubripes(♂)F1代(简称杂交东方鲀)及其亲本(均为人工养殖的3龄鱼)肌肉营养成分进行了测定与分析。结果表明:杂交东方鲀肌肉粗蛋白质与亲本无显著性差异(P>0.05),粗脂肪、粗灰分和必需氨基酸总量显著高于两亲本(P<0.05);杂交东方鲀肌肉鲜味氨基酸含量与菊黄东方鲀无显著性差异(P>0.05),而显著高于红鳍东方鲀(P<0.05);杂交东方鲀肌肉饱和脂肪酸含量与亲本无显著性差异(P>0.05),不饱和脂肪酸含量与红鳍东方鲀无显著性差异(P>0.05),而显著高于菊黄东方鲀(P<0.05);杂交东方鲀富含K、P、Na、Mg、Ca和Se等元素,其中K含量显著高于菊黄东方鲀(P<0.05),P含量介于两亲本之间且有显著性差异(P<0.05),Na含量显著高于两亲本(P<0.05),Se含量显著高于红鳍东方鲀(P<0.05);杂交东方鲀必需氨基酸指数(86.38)显著高于两亲本(P<0.05)。本研究表明,杂交东方鲀的肌肉营养成分综合了双亲的优良性状,是一种高蛋白、低脂肪且富含必需氨基酸、不饱和脂肪酸及微量元素的优质鱼类。     

温度对不同体质量红鳍东方鲀幼鱼耗氧率和排氨率的影响

在实验室条件下,进行了3种温度(15、20、25℃)对体质量分别为(23.9±2.0)、(30.1±1.5)、(43.8±1.6) g的红鳍东方鲀Takifugu rubripes幼鱼呼吸和代谢的影响试验。结果表明：在温度为15~25℃时,红鳍东方鲀幼鱼的耗氧率( RO )和排氨率( RN )均随着温度的升高而增大, RO和RN与温度( T)之间的关系符合指数函数关系;红鳍东方鲀幼鱼的耗氧率和排氨率均随着鱼体质量的增加而减少, RO和RN与体质量( W)之间的关系符合幂函数关系;红鳍东方鲀幼鱼的O/N值随温度的升高而降低,随体质量的增加而升高。研究表明,在试验温度范围内,红鳍东方鲀幼鱼对温度的敏感性相对较弱,温度变化对其代谢的影响较小,且红鳍东方鲀幼鱼摄取的主要能源物质是蛋白质。     

河鲀鱼资源的综合利用前景广阔

一、我国河鲀鱼资源现状河鲀鱼在世界各地分布较广,品种较多,现初步查明有43种,其中在我国就有35种,大部分是东方鲀属,分布在东海、黄海、渤海。进入鸭绿江口下游水域的河鲀鱼主要有5种,即黄鳍东方鲀(地方名:花廷巴)、菊黄东方鲀(黄廷巴)、虫纹东方鲀(面廷巴)、假睛东方鲀(黑罗子)、红鳍东方鲀(红鳍)。     

红鳍东方鲀及杂交鲀的脑和肾脏转录组比较分析

为探究杂交鲀(红鳍东方鲀×菊黄东方鲀)与红鳍东方鲀差异的分子调节机制,利用Illumina高通量测序技术对红鳍东方鲀及杂交鲀的脑、肾脏样本组织进行转录组测序,筛选差异表达基因。结果表明:通过RNA-seq技术共筛选到2 207个DEGs (脑)和1 823个DEGs (肾脏)。其中在脑组织样本中有1 068个DEGs表达上调,1 139个DEGs表达下调,肾脏组织样本中有851个DEGs表达上调,972个DEGs表达下调;通过GO功能分类与KEGG富集分析,将脑组织的差异基因区分为60个功能类别及137个代谢途径,包括G蛋白偶联受体信号通路、跨膜转运、分子功能调节剂、钙离子结合等;肾脏组织的差异基因被区分为31个功能分类及142个代谢途径,包括氧化还原酶活性、肽酶活性、蛋白水解、细胞外区域等。该研究探讨了杂交鲀与红鳍东方鲀生长发育差异过程的相关分子调控机制,可为后续相关研究提供初步理论参考与依据。     

壳寡糖对红鳍东方鲀血液指标和非特异性免疫指标的影响

为研究壳寡糖(chitosan-oligosaccbarides,COS)对红鳍东方鲀Takifugu rubripes血清和血液生化指标及非特异性免疫指标的影响,选用体质量为(129.2±3.1)g的红鳍东方鲀600尾,随机分为C0、C1、C2、C3 4组,每组设3个平行,在基础饲料中分别添加0、500、1000、2000 mg/kg的壳寡糖,经56 d饲养后,测定其血液指标、抗氧化酶活性及其攻毒耐受性。结果表明:饲料中添加壳寡糖能显著提高血清中碱性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力和全血中血小板数量(P0.05),各项指标随壳寡糖添加量的增加整体呈升高趋势;饲料中添加壳寡糖能显著提高红鳍东方鲀肝脏组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力(P0.05),显著降低丙二醛含量(P0.05);壳寡糖能明显提高红鳍东方鲀对迟缓爱德华氏菌和哈维弧菌的抵抗力。研究表明,在本试验条件下,饲料中添加2000 mg/kg壳寡糖能够提高红鳍东方鲀的非特异性免疫功能。     

红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究

[目的]旨在克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,并通过构建真核表达载体pCMV-3Tag-4A-PPARγ,分析myc-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用RT-PCR技术克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,构建pCMV-3Tag-4A-PPARγ重组质粒,转染至大鼠L6细胞,共聚焦显微镜下观察myc-PPARγ的亚细胞定位。[结果]红鳍东方鲀PPARγ基因cDNA ORF全长1557 bp,共编码518个氨基酸,pCMV-3Tag-4A-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞核中表达,为深入探讨鱼类PPARγ生物学功能奠定了基础。     

红鳍东方鲀鱼卵孵化和育苗试验

红鳍东方鲀（Fugurubripes）属鲀形目（Telraodontiformes），东方鲀属（Fugu），以日本沿海为主要分布中心[成庆泰等，1975]，在我国沿海自然数量较少，日渐罕见[雷霁霖等，1992]。由于与假睛东方鲀（Fugupseudommus）的形态、习性、种间关系相近等常混杂在一起，种群数量小，亲鱼来源越来越困难。同时对日本出口常引起鱼种纠纷。鉴于此，我们承担了农业部下达的“九五”引种课题，1996年5月24日从日本引进了红鳍东方鲀受精卵10000粒，5月26日抵达青岛小麦岛试验基地，并在该基地进行了人工孵化和幼鱼培育。1材料与方法1．1小麦岛试验基…     

红鳍东方鲀鱼卵孵化和育苗试验

红鳍东方鲀（Fugurubripes）属鲀形目（Telraodontiformes），东方鲀属（Fugu），以日本沿海为主要分布中心[成庆泰等，1975]，在我国沿海自然数量较少，日渐罕见[雷霁霖等，1992]。由于与假睛东方鲀（Fugupseudommus）的形态、习性、种间关系相近等常混杂在一起，种群数量小，亲鱼来源越来越困难。同时对日本出口常引起鱼种纠纷。鉴于此，我们承担了农业部下达的“九五”引种课题，1996年5月24日从日本引进了红鳍东方鲀受精卵10000粒，5月26日抵达青岛小麦岛试验基地，并在该基地进行了人工孵化和幼鱼培育。1材料与方法1．1小麦岛试验基…     

红鳍东方鲀源哈维弧菌毒力基因检测及分型研究

为探明红鳍东方鲀源哈维弧菌所携带毒力基因的种类对致病性的影响,以从辽宁地区患病红鳍东方鲀中分离得到的24株哈维弧菌为材料,根据GenBank公布的基因序列,设计合成引物,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)对7种毒力基因flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh进行检测。结果表明,24株哈维弧菌中均检测出鞭毛蛋白flaB基因和flaC基因,其余5种基因均未检测到。同时对24株哈维弧菌进行了BOX-PCR扩增,结果将其分为4种基因型,记为A1-A4型。     

红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白的提取及主要理化性质的研究

以红鳍东方鲀鱼为原料,从其皮中提取酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC)。在此基础上,分析了红鳍东方鲀胶原蛋白的结构组成和纯度、热变性、氨基酸组成等基本理化性质。结果表明:红鳍东方鲀鱼皮中酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白纯度分别高达83.19%和85.00%;将所得胶原蛋白分别经紫外光谱分析、傅里叶红外光谱分析和SDS-PAGE电泳测定,确定酸溶性和酶溶性胶原蛋白符合Ⅰ型胶原蛋白的特征,三螺旋结构完整;经测定,ASC和PSC热变性温度分别为29.85和30.10℃。