拟黑多刺蚁5-HT2A受体基因cDNA的克隆及表达

【目的】克隆拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)5-HT2A受体基因的cDNA序列,并对其核苷酸序列和系统进化进行分析,检测其在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫和不同品级成虫mRNA的表达情况,为探究5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁生长发育的调控规律提供证据。【方法】从拟黑多刺蚁中提取总RNA,RT-PCR扩增并克隆Pv5-HT2A受体基因;用ProtParam预测蛋白质序列,Blast比较蛋白质序列同源性,用Clustal X进行核酸和氨基酸序列比对,MEGA 6.0比邻法生成系统进化树。利用荧光实时定量PCR检测Pv5-HT2A受体基因在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫及不同品级成虫mRNA的表达水平。【结果】克隆得到Pv5-HT2A受体基因的cDNA序列,全长2 965bp,开放阅读框长1 926bp,编码641个氨基酸。疏水性分析显示,Pv5-HT2A受体氨基酸具有7个跨膜疏水区,属于典型的G蛋白偶联受体类型。系统发育分析表明,拟黑多刺蚁与红收获蚁的亲缘关系最近,相似度达69%。荧光实时定量PCR结果显示,拟黑多刺蚁5-HT2A mRNA在不同发育阶段和不同品级成虫中均有表达,其中卵、3龄幼虫及蛹期的表达量较高;成虫中,雄蚁表达量最高,雌蚁的表达量最低。【结论】拟黑多刺蚁与其他昆虫的5-HT2A受体基因存在相关性,推测5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁的生长发育具有一定调节作用。     

拟黑多刺蚁mAchR基因发育表达的荧光实时定量RT-PCR检测

【目的】研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体(Muscarinic cholinergic receptor,mAchR)在拟黑多刺蚁个体发育中的表达情况,探讨其是否参与拟黑多刺蚁的个体发育行为。【方法】采用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法,检测拟黑多刺蚁卵、幼虫、蛹和成虫个体发育阶段mAchR基因mRNA的相对表达量。【结果】mAchR基因在拟黑多刺蚁整个发育过程及各个品级成虫中均有表达。在卵期mAchR mRNA的表达量较幼虫期和蛹期高,而成虫期的表达量最高,可达卵期的3倍以上。3个成虫品级之间,工蚁的表达量最高,雄蚁和雌蚁的表达量在统计学上差异不显著。【结论】mAchR基因参与了拟黑多刺蚁的发育行为,而其主要功能可能是在调节成虫更为复杂的行为中起作用。     

拟黑多刺蚁雌性生殖系统的比较观察

[目的]研究不同发育时期的拟黑多刺蚁雌性生殖系统的特点。[方法]通过解剖,观察拟黑多刺蚁雌性成虫不同的发育时期（婚飞前、产卵旺盛期和老龄期）的生殖系统的特点,比较其卵巢发育指数和雌性附腺发育指数。[结果]产卵旺盛期的蚁后卵巢发育指数最高,老龄期及婚飞前蚁后次之,它们之间存在显著性差异;产卵旺盛期蚁后的雌性附腺发育指数值是最高的,婚飞前与老龄蚁后的值次之,且它们之间也存在显著性差异。结果表明蚁后的生殖能力与其卵巢的发育指数和雌性附腺的发育指数有密切的相关性,值越大,产卵能力越强。[结论]该研究为拟黑多刺蚁的人工养殖提供了理论依据。     

拟黑多刺蚁内生殖系统的观察

首次对拟黑多刺蚁内生殖进行系统解剖观察。结果发现,拟黑多刺蚁的雌性生殖系统由卵巢、输卵管、中输卵管、受精囊、生殖腔和雌性附腺等结构组成,为典型的多滋式卵巢;雄性生殖系统由精巢、侧输精管、输精管、贮精囊、射精管、雄性附腺及阴茎等结构组成,雄性附腺发达,贮精囊不明显,婚飞前雄蚁的精巢及精巢小管已逐渐退化,精巢小管的数量与其他种类蚂蚁存在一定差别。     

拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

【目的】对拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi),为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA,反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用T7RiboMAXTM Express RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),将其配制成120,60,30,15和7.5ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi,共饲喂14d,记录成虫死亡率,确定dsRNA最适质量浓度,并以此剂量对各品级成虫进行干扰,通过荧光实时定量PCR,检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USP mRNA表达的影响。【结果】成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段,其长度523bp,并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现,dsRNA质量浓度越大,拟黑多刺蚁死亡率越高,在dsRNA质量浓度为120ng/μL时,饲喂5d后成虫全部死亡;30ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30ng/μL dsRNA干扰后,荧光实时定量PCR结果表明,拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后,EcR的表达没有显著变化,USP的表达显著降低。【结论】采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达;hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。     

药用蚂蚁的养殖技术

目前，我国药用蚂蚁主要是“拟黑多刺蚁”。人工饲养药蚁具有繁殖快、风险小、投资少、效益大等特点。现将药蚁养殖技术要点介绍如下：[第一段]     

拟黑多刺蚁生活史研究及幼虫龄期划分

【目的】对拟黑多刺蚁发育生活史及成虫不同品级形态与分工进行详细观察描述,并对幼虫龄期划分进行研究。【方法】在自然光照、温度(26±3)℃、相对湿度45%~55%的条件下,观察拟黑多刺蚁发育生活史及成虫不同品级形态与分工;根据幼虫体长、头宽、体质量、消化道长,以及幼虫形态特征等数据,并结合戴氏定律,对幼虫龄期进行划分。【结果】在试验条件下,拟黑多刺蚁卵发育期为(24.5±3.5)d、幼虫发育期为(25.0±5.5)d、蛹发育期为(20.5±5.5)d。拟黑多刺蚁幼虫期可分为4个龄期,其中1龄幼虫发育时间为(4.5±1.5)d,2龄幼虫为(5.5±1.5)d,3龄幼虫为(7.0±1.0)d,4龄幼虫为(8.0±1.5)d。【结论】描述了拟黑多刺蚁不同时期的品级分工和形态,明确了拟黑多刺蚁幼虫时期的生物学特性。     

广西沼泽型水牛垂体中促性腺激素释放激素的免疫组化定位及其受体基因表达

[目的]探讨广西沼泽型水牛垂体中促性腺激素释放激素（GnRH）的细胞定位以及是否存在促性腺激素释放激素受体（GnRH—R）。为GnRH-R的克隆及其序列分析提供理论依据。[方法]采用免疫组织化学ABC法,确定促性腺激素释放激素在垂体中的定位,结合图像分析系统检测GnRH在垂体中的含量,并利用RT—PCR技术扩增其受体基因片段。[结果]腺垂体远侧部中呈现较强的阳性GnRH免疫反应,阳性物质主要分布在胞质,胞核呈阴性。神经垂体中无阳性信号。同时,在垂体中扩增出大小为1008bp的GnRH—R基因片段。[结论]腺垂体远侧部边缘区中有大量GnRH及其受体存在,证实垂体前叶是下丘脑-垂体-性腺轴以及多个内分泌轴相互作用的重要部位。     

维甲酸X受体在杂色鲍性腺发育中的调控作用研究

[目的]研究维甲酸X受体在杂色鲍性腺发育中的调控作用。[方法]采用实时定量PCR技术和RNA干扰技术,分析RXR基因在杂色鲍性腺发育过程中的表达情况。[结果]RXR基因在性腺发育增殖期的不同组织的表达量与其他发育时期相比均存在显著差异,这表明增殖期是RXR在杂色鲍性腺分化与发育发挥作用的窗口期。注射dsRXR后,dsRXR注射组维甲酸X受体在卵巢中的表达量与绿色荧光阴性对照组和空白对照组相比显著下调。这些结果证实了对杂色鲍进行活体注射双链RNA可以让体内的目的基因产生基因沉默现象。[结论]RXR基因在杂色鲍性腺发育过程中起到关键作用,并且增殖期为RXR发挥作用的窗口期。     

雄激素对去势大鼠弓状核AR蛋白表达的影响

为了探讨雄激素（androgen）对去势大鼠弓状核（ARC）内雄激素受体（AR）表达的影响。将30只3月龄雄性健康SD大鼠随机分为GM组（睾丸摘除组）、IMC组（假手术组）、GM＋T组（睾丸摘除并用睾酮替代组）,注射雄激素4周后灌注取材。结果表明,睾九摘除组大鼠弓状核内AR蛋白的表达显著减少,睾丸摘除并用睾酮替代组大鼠弓状核内AR蛋白的表达接近正常水平。说明去睾丸大鼠由于缺乏内源性雄激素,引起弓状核内AR蛋白表达减少,而补充外源性雄激素可抑制这一变化。     

试验性趾叶炎小鼠肠组织中P物质的表达

[目的]为动物趾叶炎的预防和治疗提供免疫学基础。[方法]对昆明种小白鼠注射二磷酸组织胺制备趾叶炎小鼠病理模型,以注射生理盐水为对照。分别于给药后2、14、24、48、72 h及15、30 d取小鼠3~5 mm长的小肠组织块,检测肠组织中炎性细胞、杯状细胞、肥大细胞及其脱颗粒数、P物质表达水平的动态变化。[结果]趾叶炎小鼠的肠腺结缔组织内及其绒毛上P物质表达异常丰富,且P物质呈单根或片状走行,并与肥大细胞串联及相邻排列,随给药时间的延长,P物质表达逐渐增强,肥大细胞及其脱颗粒数也急剧增多 炎性细胞、杯状细胞、腺体数量与肥大细胞的变化趋势一致 给药72 h后,血管内壁出现裂隙,肠粘膜出现水肿。[结论]肥大细胞参与小鼠趾叶炎的发病过程,并影响小鼠肠粘膜的通透性。     

取食转基因棉上的白粉虱对T纹豹蛛生长发育及捕食的影响

[目的]探讨取食转基因棉棉叶的白粉虱对T纹豹蛛生长发育及捕食的影响。[方法]在室内条件下,测定取食转基因棉和常规棉的白粉虱对T纹豹蛛发育历期、成蛛体重、死亡率、性比、耐饥力和捕食功能反应的影响。[结果]T纹豹蛛取食用转基因棉棉叶处理的白粉虱与取食普通棉叶处理的白粉虱发育历期、成蛛体重、死亡率和性比都无显著差异。捕食功能反应试验结果表明,T纹豹蛛对白粉虱幼虫的捕食功能反应符合HollingⅡ型圆盘方程;取食常规棉处理的白粉虱的T纹豹蛛猎物瞬时发现率和耐饥力显著高于转基因棉。[结论]该研究为研究转基因棉对棉田捕食天敌的影响提供了依据。     

苦杏仁精油对家蝇的触杀活性研究

[目的]研究含HCN和去HCN的苦杏仁精油对家蝇的触杀活性,为苦杏仁精油作为卫生害虫杀虫剂提供依据。[方法]采用“点滴法”测定含HCN和去HCN的苦杏仁精油对家蝇的触杀活性。[结果]2种苦杏仁精油对家蝇有很强的触杀活性,触杀活性随着处理时间的延长而增强,且去HCN的苦杏仁精油的杀虫活性高于含HCN的苦杏仁精油。[结论]苦杏仁精油对家蝇具有很强的触杀活性．可作为卫生害虫杀虫剂加以开发利用。     

基于CHD基因序列分析的帝企鹅性别鉴定研究

［目的］分析帝企鹅（Aptenodytes forsteri）CHD基因序列,以鉴定性别。［方法］采用苯酚∶氯仿抽提法提取6只未知性别的帝企鹅血液中的基因组DNA,运用P2/P8引物扩增CHD基因片段,将PCR产物克隆到T Vector,利用NCBI的Blast 程序,以短趾鹰（Circaetus gallicus）同源序列为比对参照,将帝企鹅CHD基因片段序列与GenBank 中的基因片段序列进行同源性比较分析,鉴定帝企鹅的性别。［结果］测序结果表明,CHDZ和CHDW基因的PCR产物大小分别为378、387 bp,雌雄结果并不明显,不易区分开来。Blast比对结果表明,帝企鹅LD、EK、ZF为雄性,帝企鹅DG、YA、YY为雌性。［结论］结合PCR扩增和测序分析CHD基因,是单态性鸟类性别鉴定的有效和准确的方法。     

胡杨异形叶蛋白质表达的电泳分析

[目的]研究胡杨异形叶发育的细胞与分子调控机制,揭示胡杨的生态适应性。[方法]利用SDS-PAGE及2-DE技术提取及分离同一株胡杨成年树异形叶片的蛋白质,建立适合胡杨叶片蛋白质分离的电泳技术。[结果]发现异形叶蛋白质的表达存在明显差异。由SDS-PAGE图谱可以看出,分子量为57.2,13.2,30.2,23.9,35.9及33.3 kD处的蛋白谱带差异明显。双向电泳图谱表明,胡杨叶蛋白多为分布在pH值5.0~6.5,20~40 kD之间的酸性低分子量蛋白质;共发现73个差异点,其中在锯齿卵圆形叶片中表达丰度上调的为51个点,下调的为22个点。[结论]推测在长期的进化过程中,胡杨叶片基因的调控表达发生改变而长出不同形状的叶片,以更好地适应环境。     

牛表皮祖细胞的体外分离培养

[目的]探索和建立牛表皮祖细胞体外分离与培养体系。[方法]无菌取3个月龄的胎牛皮肤组织,用组织块法培养获得细胞,用L—DMEM培养基（添加5％FBS,0．05mmol／LCaCl2,20ng／mlEGF,20ng／mlbFGF,1％B-27,0．4斗g／mlhydrocortisone）置细胞培养箱内培养。在显微镜下观察细胞的克隆形成能力,免疫细胞化学染色鉴定a6、B1整合素。[结果]获得的细胞有很高的克隆形成能力,a6、p1整合素免疫细胞化学染色阳性。RT—PCR检测结果表明,P,代时Oct4基因有表达,但传代超过P11代时,Oct4基本不表达。[结论]该研究可为进一步采用组织工程技术构建皮肤组织奠定基础。     

性比对非繁殖期圈养白鹇行为的影响

[目的]为了探讨性比对个体行为的影响。[方法]2007年9~11月在广东象头山国家级自然保护区采用随机取样法和瞬时扫描取样法开展了3种性比圈养白鹇的行为学研究。[结果]不同性比的白鹇都具有明显的日节律:取食高峰出现在16:00~17:00,休息高峰在12:00~13:00。在时间分配上,同一性比的雄性与雌性间存在差异:性比为2∶2时,雄性与雌性在游走和休息上的差异极显著(P<0.01);性比为3∶1时,雄性与雌性在取食和游走的差异极显著(P<0.01)。不同性比的同性间仍存在差异∶雄性在性比为2∶2与3∶1时游走的差异极显著(P<0.01);雌性在性比为2∶2与3∶1时取食和游走的差异极显著(P<0.01),并在性比为3∶1与3∶0时取食和游走的差异极显著(P<0.01)。不同性比的白鹇个体之间亲疏关系不同,但总有2只雌性个体关系密切。[结论]性比对白鹇圈养白鹇的行为时间分配有影响,而且雌性个体更趋于集群活动,雄性则趋于单个活动。     

高脂日粮对初情期小鼠乳腺发育的影响及分子机制

【目的】研究高脂日粮对初情期小鼠乳腺发育的影响及可能机制。【方法】选用20只4周龄昆明雌性小鼠,设对照组和高脂日粮组,试验期4周,每周称体质量并统计采食量。试验结束后采集小鼠乳腺并称质量,采用wholemount及HE染色观察小鼠乳腺组织形态结构及导管数量。利用Western blot检测初情期小鼠乳腺组织胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor1,IGF-1)、增殖相关信号通路关键蛋白蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、胞外调控的蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase,Er K)以及炎症信号通路关键蛋白Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和核因子κB激酶抑制剂(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)的表达。【结果】高脂日粮组小鼠采食量极显著低于对照组(P0.01),但在能量摄入方面与对照组无显著差异。高脂日粮组小鼠的体质量增加显著高于对照组(P0.05)。高脂日粮组小鼠在乳腺质量、乳腺质量与体质量的比值上均极显著高于对照组(P0.01)。乳腺组织的whole-mount及HE染色结果表明,高脂日粮组小鼠乳腺导管发育明显被抑制,其乳腺组织的导管数和密度明显降低,乳腺组织的终末乳芽数量也极显著低于对照组(P0.01)。高脂日粮能够显著抑制小鼠乳腺组织IGF-I的蛋白表达以及Akt、Erk和IKK的磷酸化水平(P0.01或0.05),极显著促进小鼠乳腺组织TLR4的蛋白表达(P0.01)和显著促进JNK的磷酸化水平(P0.05)。【结论】高脂日粮能够抑制初情期小鼠乳腺发育,这可能是通过抑制乳腺增殖的相关信号和促进乳腺组织炎症的相关信号来实现。     

口虾蛄促雄腺的形态结构研究

[目的]对口虾蛄的形态结构进行观察。[方法]利用组织切片技术观察雄性口虾蛄(Oratosquilla oratoria)促雄腺的形态结构特征。[结果]口虾蛄促雄腺1对,乳白色,呈椭圆形,分别位于第三步足的交接肢基部内侧,包埋于肌肉、肝胰腺之间,通过组织膜附着在输精管表面。腺体发育分为3个时期:增殖期、合成期和分泌期。腺体的分泌方式为全浆式。[结论]该研究结果可为丰富口虾蛄繁殖生物学的研究提供基础资料。