凡纳滨对虾Toll样受体基因cDNA片段的克隆及序列分析

对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Toll样受体基因的cDNA片段进行了克隆.从凡纳滨对虾提取肌肉、鳃和肝胰腺中的总RNA,根据黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Toll样受体的TIR区设计引物,从鳃中逆转录扩增得到cDNA序列,进行测序.所得序列结果与其他物种的已知TIR及TLR氨基酸序列进行聚类分析建立系统进化树,并进行氨基酸序列同源性比较.结果表明所得序列与斑节对虾(Penaeus monodon)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、果蝇(Drosophila melanogaster)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)、线虫(Caenorhabditiselegans)、紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus)的Toll样基因TIR区域的氨基酸序列有较高的相似性.     

罗氏沼虾Toll样受体基因cDNA片段的克隆及序列分析

提取罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)上海养殖群体活体鳃、肌肉、肝胰腺、血液和雄性腺5种组织的总RNA;应用RT-PCR技术,从鳃组织中克隆到Toll样受体(TLR)基因部分cDNA序列,并进行生物信息学分析。基因序列分析表明:所得罗氏沼虾TLR基因cDNA序列长1 875 bp,包含1 728 bp的开放阅读框,可编码575个氨基酸残基;该部分TLR是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRR-CT、LRR-NT结构域及关键的胞内区TIR结构域,具备Toll样受体家族的典型结构特征;TIR结构域与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、拟穴青蟹(Scylla paramamosian)Toll样受体基因TIR区域的氨基酸序列具有很高的相似性。     

凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA组织表达的差异研究

采用荧光定量PCR技术,检测了凡纳滨对虾不同组织(血淋巴、鳃、肌肉和肝胰腺)中Toll受体和溶菌酶mRNA的相对表达量。结果表明:凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA在不同组织间的表达量存在显著差异。Toll受体mRNA在各组织中的相对表达水平由高到低顺序依次为血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺。溶菌酶mRNA表达水平则依次为血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺,但血淋巴和鳃之间无显著差异。溶菌酶mRNA和Toll mRNA表达量重复测定间的变异度在血淋巴和鳃组织间无显著差异。表明鳃和血淋巴是检测凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的相对表达量的理想实验材料。研究亮点:Toll受体能够将异物入侵的信号从细胞外传递到细胞内并引起胞内信号级联反应产生各种免疫效益因子,因此其表达水平一定程度上可以反映对虾对病原入侵的灵敏性。溶菌酶活性是评判对虾免疫抗菌能力的重要指标。研究Toll受体和溶菌酶基因表达的组织差异性,可以为后续开展对虾营养免疫学研究中免疫相关基因检测时实验材料的选取提供理论基础。     

凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

[目的]分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化.[结果]LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)cDNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸.LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近.LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低.经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化.[结论]WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定.LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用.     

凡纳滨对虾eIF5A基因的克隆及表达分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是真核生物细胞内的蛋白质翻译起始因子.近年来的研究发现eIF5A在动植物细胞衰老死亡、环境胁迫应答和免疫应答等过程中起着重要的调控作用.通过对凡纳滨对虾cDNA文库进行测序,首次获得了包含eIF5A完整的氨基酸序列的cDNA.该cDNA包含474 bp的开放阅读框,编码157个氨基酸,预测分子量约为17.257 ku,理论等电点为5.06.凡纳滨对虾eIF5A和其他物种对比结果显示,该基因的氨基酸序列和其他物种有较高的同源性.实时定量RT-PCR结果显示,eIF5A基因在凡纳滨对虾不同组织中的mRNA表达没有明显的差异.对WSSV、TSV和IHHNV感染的凡纳滨对虾的肝胰腺的实时定量RT-PCR结果显示,病毒感染的凡纳滨对虾的eIF5A基因的表达明显增加,分别是对照样品表达量的2.2、2.5和1.6倍,表明eIF5A可能涉及凡纳滨对虾的抗病毒免疫应答.     

凡纳滨对虾烯醇酶基因Enolase的克隆及表达分析

以生长性状分离的凡纳滨对虾家系的肌肉组织.构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库.斑点杂交筛选获得Enolase基因,克隆获得全长编码区序列.序列分析表明,序列包含1 305 by的开放阅读框.推测编码的蛋自质含434个氨基酸.预测的分子量为47.4 ku,等电点为5.67.通过荧光定量PCR法研究了Fnolase基因在凡纳滨对虾的不同组织和不同生长期的肌肉组织中的表达情况,结果显示,Fnolase基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达;在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为125 d的对虾肌肉组织中表达量量高,在口龄为80 d的对虾肌肉组织中表达量最低.     

凡纳滨对虾肌球蛋白轻链基因MLC的克隆及表达分析

以生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,斑点杂交筛选获得MLC基因,克隆获得全长编码区序列.序列分析表明序列包含462 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为153氨基酸,预测的分子量为17.5ku,等电点为4..67.通过荧光定量PCR的方法研究了MLC基因在凡纳滨对虾不同组织和不同生长期的肌肉组织中表达情况,显示MLC基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达,在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为45d的对虾肌肉组织中表达量最高,在日龄为10 d的对虾肌肉组织中表达量最低.     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

酵母提取物替代鱼粉对凡纳滨对虾免疫抗菌机能和溶菌酶mRNA及Toll受体mRNA表达的影响

以鱼粉含量为25%的饲料为对照组,分别用酵母提取物替代配方中15%、30%、45%和60%鱼粉,配制5组等氮、等能饲料投喂凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）(7.50±0.13) g 42 d,研究酵母提取物替代鱼粉对凡纳滨对虾血清免疫酶及鳃组织中溶菌酶mRNA及Toll受体mRNA相对表达量的影响,并进行溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）人工急性感染试验。结果表明：15%组血清溶菌酶（LSZ）活性显著高于对照组（P<0.05）,其余替代组与对照组无显著差异。酵母提取物部分替代鱼粉对凡纳滨对虾血清超氧化物歧化酶（SOD）活性和鳃组织中溶菌酶mRNA及Toll受体mRNA的相对表达量影响均不显著（P>0.05）;经溶藻弧菌人工急性感染后,24 h和48 h时 60%组累计死亡率显著高于对照组（P<0.05）,其余各替代组与对照组差异不显著（〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05）,72 h和96 h时各替代组与对照组差异均不显著（P>0.05）。表明以酵母提取物替代凡纳滨对虾饲料中45%的鱼粉不会显著降低凡纳滨对虾的免疫抗菌能力。