启动子在棉花基因工程中的应用与研发

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,是驱动基因转录所必需的,在转基因技术中具有重要地位.启动子分为组成型启动子、组织特异性表达启动子和诱导型表达启动子.本文阐述了三类启动子在棉花中的应用现状以及棉花内源启动子的研究进展,并对启动子在转基因棉中的应用前景进行了展望.     

蚜虫诱导的小麦基因cDNA的克隆及其表达特性分析

蚜虫是小麦的重要害虫之一,而且能传播多种病毒病(包括大麦黄矮病毒),最终导致小麦严重减产.防治虫害对小麦稳产具有重要意义.依靠化学杀虫剂防治虫害,不但费用较高而且易使害虫产生抗药性,同时还会造成农药残留和环境污染,危害人类健康.传统小麦抗虫育种周期长、见效慢.转基因技术为培育抗虫小麦提供了一条快捷、高效的方法.然而在长期选择压下,害虫对转基因作物产生抗性已成为制约抗虫作物推广应用的现实因素[1].如何防止或延缓害虫产生抗性,已经成为植物抗虫基因工程的另一重要研究内容.在目前的抗虫转基因植物中,使用最多的是组成型表达的启动子,它使抗虫基因在植物生长发育的全周期以及各种组织中都表达.这种长期的选择压,无疑会大大提高害虫对转基因植物产生抗性的几率.为了解决这一问题,人们已经开始重视使用组织特异性启动子[2]和诱导型启动子[3],使抗虫基因只在特定部位、特定时间或者只在植物受到害虫侵害时进行表达.这样就减少了害虫处于选择压下的时间,从而可以延迟或阻止害虫产生抗性.     

木质部特异性启动子缺失片段的克隆及功能分析

木质部特异性启动子可使外源基因在木质部中进行高效表达,本试验采用5'端系列缺失分析法,通过PCR扩增出杨树木质部特异性启动子MDCes AP中与其转录起始位点距离不同的5'端缺失的启动子片段MU2、MU4。将扩增片段替换植物特异性表达载体p BI121中的Ca MV35S启动子,使每个基因片段与载体中GUS报告基因相连得到重组质粒并转入农杆菌。通过烟草瞬时转化检测结果表明,缺失片段MU2、MU4均具有启动子功能,且两者活性均显著高于Ca MV35S启动子,并具有木质部组织特异性。木质部特异启动子结构特征和功能的深入研究将为确定其中决定木质部组织特异性的必要元件以及其他具有诱导活性的顺式作用元件奠定基础,从而为利用这些顺式作用元件调控外源基因在特定的时间、特定的组织器官高效表达提供可能。     

玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。     

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2.利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株.Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上.对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达.Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织.证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究.     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

以谷蛋白GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累

提高外源蛋白在特定目标组织器官中的表达量是转基因植物研究与开发的核心技术之一。谷蛋白是水稻种子中最主要的贮藏蛋白,其表达具有严格的时空特异性。为进一步研究谷蛋白信号肽序列在指导基因表达中的作用,本研究克隆了水稻谷蛋白Glu A-2基因的启动子及其信号肽编码序列,并与GUS报告基因编码区融合,构建了分别含有和不含有信号肽的表达载体p13GG和p13GSG;经农杆菌介导法分别转入同一水稻品种中,获得了20多个独立转化子,PCR证明外源基因都已整合进了水稻基因组中。Northern杂交结果表明,融合Glu A-2信号肽编码序列可显著提高GUS基因在水稻胚乳中的转录;利用GUS特异的抗体进行Western杂交分析,显示该信号肽序列可显著提高外源蛋白在转基因水稻胚乳中的积累,但是其所指导表达的GUS蛋白在水稻胚乳中并没有表现出相应的活性,其机制有待进一步深入解析。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白具有重要的指导作用。     

含双边界序列植物双价表达载体的构建

转基因植物的安全性是基因工程改良作物的一个重要问题.构建含双边界序列（双T-DNA区）载体,将选择标记基因和目标外源基因分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株有性杂交及后代分离,可在转基因后代中获得无选择标记的转基因安全植株.将2个外源基因置于同一载体上,可以提高其共转化的效率.本研究构建了1个中间载体pAHC17-PTA和1个含双边界序列的植物双价表达载体pDB13PS.pAHC17-PTA含有由Ubiquitin启动子引导的具有抗虫效果的半夏凝集素基因（PTA）.pDB13PS含2个独立的T-DNA区,在其中一个T-DNA区,含两个目的基因的完整的表达盒,一个是由Ubiquitin启动子引导的半夏凝集素基因（PTA）,另一个是由水稻胚乳特异表达启动子（Glutelin-B1 promoter）驱动的马铃薯高赖氨酸蛋白基因的cDNA（SB401）.pDB13PS的成功构建,为提高PTA和SB401的共转化效率和获得无选择标记的转基因后代植株奠定了基础.     

棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7~10.9倍。结果表明MPBQ MT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

植物基因工程在作物育种中的应用与展望

从抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆以及品质改良、改善发育状况、提高光合作用和固氮效率等方面论述了基因工程在作物育种中的具体应用和进展,阐述了基因工程改良作物品种的方法和优点。通过植物基因工程获得的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜和烟草,并开始大面积应用于农业生产,取了得较好的经济效益、社会效益和环境效益。分析了植物基因工程在作物育种中广阔前景,有望培育出高产优质、集高光效、抗虫、抗病、抗除草剂和抗逆等特性于一体的作物新品种。解决了人类所面临的资源短缺、环境恶化和效益衰退的三大难题,为农业的持续、稳定发展提供了有力保障。     

GAFP基因导入对彩色棉抗病性和农艺及经济性状的影响

通过对转GAFP基因品系ZB-1-31、ZB-1-49、LB-7-8与原受体品种新彩棉1号、绿9903进行了抗枯、黄萎病性的对比和农艺、经济性状方面的对比研究,结果表明,3个转GAFP基因品系对枯、黄萎病的抗性显著高于受体品种,生育期有所提前,产量均明显高于受体品种,纤维品质也有不同程度的提高。     

水稻组织特异型人工合成启动子的设计、构建及功能鉴定

合成启动子是合成生物学的一个重要研究领域及研究热点。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,亦是禾本科作物功能基因组研究的模式植物。本研究旨在对水稻组织特异表达启动子的合成作有益尝试。根据已发表的文献选取了一些与组织特异表达相关的顺式元件,将它们以不同的方式组合并连接Mini 35S核心启动子以驱动GUS报告基因的表达。转基因水稻的GUS组织化学染色和酶活测定结果证实,通过上述方法在水稻中成功构建出组织特异型合成启动子,同时也揭示了顺式元件在合成启动子中不同的组合方式对启动子的表达活性和表达模式起着关键作用。本研究为植物合成启动子的设计思路和构建方法提供了有益信息和实践基础。     

大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析

通过PCR技术从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段（BCSP489）,对此片段采用TAIL PCR技术进一步延伸,获得了启动子片段BCSP666。序列分析表明,在启动子片段BCSP666中含有多种种子特异性启动子所特有的序列元件,如A/T富含序列元件、RY重复序列元件、AGCCCA序列元件、TACACAT序列元件、A     

主要麻类作物基因组学与遗传改良:现状与展望

随着测序技术的发展,主要麻类作物(黄麻、红麻、苎麻、亚麻和工业大麻)参考基因组从2011年至2020年陆续完成测序,这标志着麻类作物科学已经进入基因组时代。文章首先详细概述主要麻类作物基因组测序。其次,评述了基于基因组学的麻类作物重要应用价值基因挖掘。基于参考基因组和转录组测序,大量关于纤维发育、响应非生物胁迫的候选基因被挖掘,以促进麻类作物纤维的物种特性和“不与粮食争好地”的逆境农业。同时不同麻类作物特异性状候选基因陆续被报道,如红麻雄性不育、亚麻种子含油量和大麻大麻素相关候选基因等。再次,麻类作物基因组测序完成为基于组学的麻类作物遗传改良提供可能:有助于麻类作物种质资源形成和演化机制研究,系统解析纤维产量、纤维品质、抗病耐逆等农艺性状形成的分子基础;有助于建立高通量基因型-表型数据库,挖掘优异基因资源与创制新种质;有助于创新并集成分子标记辅助选择、基因组选择、转基因等技术,建立高效的快速育种技术体系。宜选育高产高效、抗逆抗病、适宜轻简化机械化、优质专用的多用途麻类作物新品种,以满足麻类作物相关产业的市场需求,适应麻类作物生产方式。尽管已经获得重要基因以及位点的信息,但如何高效率利用已有基因资源对麻类作物进行遗传改良仍需面临一系列挑战,如成熟稳定的遗传转化体系、麻类作物基因编辑体系构建及基因组选择育种等。     

Herbicide-tolerant crops in agriculture: oilseed rape as a case study

Oilseed rape has been modified extensively by conventional breeding for the production of varieties useful for human consumption (blended vegetable oil and margarine) and industrial processes (rubber additives and high‐temperature lubricants). Because much is now known about its genetic and biochemical composition, it has been an obvious choice for genetic modification and is now at the forefront of the commercial development of genetically modified (GM) or transgenic crops. Around the world, the increase in commercial plantings of all transgenic crops has been rapid. In 1996, 1.7 million hectares were planted, but by 1998 this figure had jumped to 27.8 million ha. The area in the year 2001 is likely to be about 50 million ha. With the possible introduction of transgenic varieties into European agriculture, it is essential that the associated farming practices employed are appropriate for their growth, both from a commercial and an environmental viewpoint. Some of the first transgenic crops are those carrying agronomic traits, e.g. herbicide tolerance transgenes. However, before full commercialization occurs, important agronomic and environmental questions need to be answered. How are these new crops to be incorporated into existing cropping practices? How will this change the current herbicide use profile for a given crop? Do herbicide‐tolerant varieties enhance or impede integrated pest management schemes? What is the likely uptake of such crops in agriculture? What are the ecological implications of their introduction? Are there effective measures to control the spread of transgenes to wild relatives? This paper addresses these questions, with special emphasis on oilseed rape production in the UK, but includes examples from other crops and countries where appropriate.     

HC-Pro基因片段介导的高抗TuMV

芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses,TuMV)是侵染重要经济作物的主要病毒之一,寄主范围十分广泛,尤其是对十字花科作物的危害最为严重。为了获得对TuMV持久稳定的高度抗性,本研究以TuMV HC-Pro基因的453 bp保守序列为靶标,构建了植物表达RNAi载体pBBBTu-HC-Pro,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。对转基因拟南芥用北京地区流行的TuMV强致病株BJ-C4进行了抗病接种鉴定。鉴定的13个单拷贝转基因株系中有4个对TuMV的BJ-C4株表现出高度抗性,抗性比对照提高约80%以上,且抗性可以稳定遗传。经半定量和荧光定量PCR方法检测,在高抗转基因植株体内几乎检测不到病毒的累积,抗病效果明显。该载体在利用基因工程抗TuMV育种中具有广阔的应用前景。     

转基因玉米研究进展

植物转基因技术开辟了作物遗传改良的新途径。转基因玉米是植物基因工程领域研究的热点之一。近年来,应用转基因技术已经获得抗虫、抗除草剂和其他有用性状的转基因玉米。在此,就玉米转基因在受体系统、目的基因及转化方法方面的研究成果,尤其是近年来玉米转基因研究方面存在的问题、解决途径以及其他类型玉米的转基因研究进展做了综述。