金莲花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立金莲花ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以内蒙古自治区境内野生金莲花为试验材料,采用L₁₆(4⁵)正交实验设计,对影响ISSR-PCR扩增结果的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、Mg²⁺、引物5个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化。结果显示,每个因素都具有极显著差异,影响最大的为dNTPs,其余依次为Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物,影响最小的为Mg²⁺浓度。最佳反应体系为:DNA模板30 ng,引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/20μL,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg²⁺1.0 mmol/L,反应总体积20μL。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸100 s,最后72℃延伸7 min,共38个循环,4℃保存。采用优化后的体系对金莲花不同居群进行验证,证明优化后体系扩增出明亮清晰的条带且重复性好,可用于后续金莲花遗传多样性分析。     

毛竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg²⁺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA浓度及退火温度对毛竹ISSR-PCR扩增效果的影响。毛竹ISSR-PCR反应体系为:25μL的体系中含Mg²⁺1.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,模板DNA 30 ng,10×Buffer2.5μL。扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54℃退火60 s,72℃延伸1.5 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该体系稳定、可靠,可用于毛竹遗传多样性分析。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材,对影响ISSR-PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg2+,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选.确立了适合刺梨ISSR-PCR分析的最佳反应体系,即20 μL反应体系中各组分浓度分别为:10×buffer2.0 μL,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,dNZPs0.1 mmol/L,引物2.μ mol/L,模板DNA20ng.PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性1 min,48℃退火温度45 s,72℃延伸1 min,34个循环,72℃后延伸6min.利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测,结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好.     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

花吊丝竹ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究利用L16(45)正交试验设计,对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,Taq DNA聚合酶浓度,引物浓度及模板DNA含量)进行优化。并在50~60℃范围内摸索引物UBC845的最适退火温度,并建立了花吊丝竹的最佳ISSR-PCR反应体系:2.5 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,80 ng模板DNA,2μL 10x Buffer,9.5μL dd H2O,ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。利用优化的反应体系从100条引物中筛选出16条多态性较好的引物,该体系的建立有助于花吊丝竹种质资源遗传多样性分析和指纹图谱的构建。     

草莓SRAP反应体系优化及引物筛选

为建立草莓SRAP-PCR适宜的反应体系,以草莓品种‘丰香’为实验材料,采用单因素实验设计,对Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物浓度4个因素4水平进行优化,并在此基础上对模板DNA的浓度和退火温度进行优化。结果表明,草莓SRAP-PCR最佳反应体系为：20μL的反应体系中含10×PCR buffer 2μL,Mg²⁺ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,正反向引物各为0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为100 ng。扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。利用该优化体系筛选引物,从110对SRAP引物组合中筛选出29对条带清晰丰富、多态性好的引物,证明了此优化体系稳定可靠,能够用于草莓种质资源的鉴定、分子标记辅助育种等研究。     

巴戟天ISSR体系的建立与优化

以巴戟天叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于巴戟天的ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件,即20μl PCR反应体积中含0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,50 ng模板DNA.PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,53.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.应用该ISSR体系对6份巴戟天种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。     

黄枝油杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

先运用正交设计进行初步筛选,再用单因素设计逐一优化对ISSR-PCR扩增效果有影响的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA、循环次数及退火温度.建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序,即25μL体系中含2.0mmol/L的Mg2+、1.5U Taq DNA聚合酶、0.10mmol/L的dNTP、1.0μmol/L的引物、30ng的模板DNA以及2.5μL10×PCR buffer,其余的用灭菌的ddH2O补够25μL.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～56℃(不同的引物,其退火温度不同,根据具体引物而定)退火45s,72℃延伸90s,以上3个步骤循环50次;最后72℃延伸7min;扩增产物放在4℃冰箱中保存.该体系和程序稳定性良好,结果可靠,可用于黄枝油杉遗传多样性分析.     

百合属ISSR反应条件优化的研究

建立一个稳定性高、重现性好,适合百合ISSR遗传差异分析的PCR反应体系。设定反应体系中各因子的不同浓度并进行PCR扩增,依据稳定性高、重现性好的原则,对该反应体系进行调整与优化,最终建立稳定可靠的ISSR反应体系。适于百合ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为：40 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg²⁺,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.8μmol/L引物,200μmol/L dNTPs;扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,51.8℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35个循环;最后72℃延伸8 min。所建立的百合ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、检测多态性能力强等特点,为应用ISSR标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了技术基础。     

新疆野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合新疆野生欧洲李的ISSR-PCR反应体系,本研究以野生欧洲李为供试材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计和单因素试验设计相结合的方法,对影响野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的5个因素(DNA模板,Taq酶,dNTPs,引物,Mg²⁺)进行筛选与优化,对16条引物的退火温度进行筛选。结果表明,Taq酶对PCR扩增反应的影响最大,野生欧洲李ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积20μL,5 U Taq酶0.10μL,10 mmol/L引物1.00μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.50μL,10×Buffer(含Mg²⁺)2.00μL,50 ng/μL DNA模板1.00μL,双蒸水14.40μL。建立的ISSR-PCR反应体系经过22份野生欧洲李样品验证,表明反应体系稳定可靠,可用于后续遗传多样性研究,为野生欧洲李种质资源的保护和利用提供理论参考。     

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

枇杷ISSR扩增反应体系的优化

采用正交设计对影响枇杷ISSR-PCR的模板DNA、dNTPs、Primer、Taq酶及Buffer(含Mg2+)进行优化。试验结果表明:20μL反应体系中,含模板DNA5ng、dNTPs0.25mmol/L、Primer0.25μmol/L、Taq酶0.5U和10×Buffer(含Mg2+)3μL。此外,从95条ISSR引物中筛选出11条具有丰富的多态性位点的引物,同时优化各引物退火温度。     

砂梨的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以砂梨基因组为材料,通过单因素试脸,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合砂梨的ISSR-PCR反应体系和应用程序为为: 20 μl PCR体系中,1 x Taq 酶配套缓冲液,0.5 U Taq DNA 聚合酶,0.7μmol / L引物,100μmol / L dNTPs,2.25 mmol/LMgCl2,40ng模板DNA。最佳扩增程序为：预变性：94°C 5min; 94°C变性45sec,52°C退火45sec,72°C延伸1min;共40个循环后,最后72°C延伸10min,4°C保存。用引物836可以将这16份砂梨材料区分开。砂梨ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行砂梨品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析莫定了良好基础。     

正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究(英文)

以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。     

黄皮ISSR－PCR反应体系的优化

摘 要：采用单因素和正交试验对ISSR-PCR扩增黄皮基因组DNA的主要影响因子进行筛选和分析,建立了适宜于黄皮ISSR分析的扩增体系：20 μL的反应体系中含30 ng的模板DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、0.3mmol/L dNTPs以及引物(gA)8C的最佳退火温度为52.4℃。