一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考。本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析。结果从患病中华鳖体内分离纯化得到一株致病菌,命名为AM-1,经鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);用该菌进行人工感染得到的症状与自然发病中华鳖症状一致;该菌对恩诺沙星和左氧氟沙星等药物敏感,对复方新诺明、氨苄西林和四环素等不敏感。毒力基因检测显示,该嗜水气单胞菌AM-1分离株携带气溶素、热不稳定性肠毒素、热稳定性肠毒素、溶血素、弹性蛋白酶5种毒力基因。最终表明嗜水气单胞菌AM-1是引起此次中华鳖发病的病原,可以使用恩诺沙星和左氧氟沙星等药物进行防治。     

半刺厚唇鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定

对典型症状为皮肤溃烂、体表出血、肝脏肿大的养殖半刺厚唇鱼(Acrossocheilus hemispinus)进行细菌的分离、鉴定和药物敏感性研究。从患病半刺厚唇鱼肝组织分离纯化细菌,并肌肉注射回归感染健康半刺厚唇鱼。PCR扩增获得分离菌株16S rDNA序列和gyrB基因全长序列,并开展分离菌株生理生化鉴定,毒力基因检测以及药物敏感性实验。分离菌株编号为AS0829L1,人工回归感染实验结果表明菌液浓度5×10¹⁰、5×10⁹、5×10⁸CFU/mL可分别导致健康半刺厚唇鱼100%、100%和28.6%的死亡率,BLAST显示其16S rDNA序列和gyrB基因与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的相应序列高度同源,同源性分别高达99.93%和99.34%。综合分子生物学、生理生化特征、毒力基因检测结果证明分离菌株AS0829L1为维氏气单胞菌温和生物型(A.veronii bv.sobria)。药物敏感性实验显示,分离菌株对头孢曲松、头孢派酮、庆大霉素、新霉素、恩诺沙星、氧氟沙星等20种药物高度敏感,...     

黄瓜白粉病的生防细菌筛选及鉴定

为开发黄瓜白粉病的生防资源,与三七根腐病菌、禾谷镰刀菌和柑橘炭疽病菌进行平板对峙培养,从25株黄瓜根际土细菌和91株烟草内生细菌中筛选出具拮抗功能的菌株;以盆栽试验从拮抗功能菌株中筛选能够防治黄瓜白粉病的生防菌株;用PCR扩增生防菌株的gyrB基因,结合菌株的菌落形态和部分生理生化特征,确定生防菌株分类地位。结果表明,在116株对峙培养细菌中,18株对三七根腐病菌、禾谷镰刀菌和柑橘炭疽病菌有较好拮抗效果。在盆栽试验中,烟草内生菌YN-201490和黄瓜根际菌株WL-1对黄瓜白粉病防效较好,其中YN-201490的1.81×10⁸ cfu/mL和WL-1的1.6×10⁸ cfu/mL稀释液连续施用3次后的防效分别达64.86%和61.26%。最终YN-201490被鉴定为枯草芽孢杆菌,WL-1被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。     

番茄产后灰霉病的病原鉴定及生物防治

为探索生物防治番茄产后灰霉病,采用柯赫氏法则从罹病的番茄果实上分离得到菌株FQ-2,基于形态学和rDNA-ITS序列,对该菌株进行病原鉴定,采用小麦内生菌解淀粉芽孢杆菌 B9601-Y2(Y2)和球花石斛内生菌贝莱斯芽孢杆菌DJB5(DJB5)对番茄灰霉病进行生物防治。FQ-2被鉴定为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),且Y2和DJB5对番茄产后果实灰霉病均有较好的预防和治疗效果,Y2 1×10⁷ cfu/mL和DJB5 1×10⁸ cfu/mL悬浮剂在处理当天接种FQ-2,10天后的防效分别达88.10%和73.47%。在接种灰霉病菌当天再接种1×10⁸cfu/mL的Y2和1×10⁷ cfu/mL的DJB5,10天后灰霉病的防治效果分别达68.56%和78.74%。研究结果对番茄产后灰霉病的生物防治具有参考作用。     

抗草甘膦真菌(Candida palmioleophila)分离鉴定及其cDNA文库构建

利用瓶培养富集技术从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选抗草甘膦菌株,通过菌株形态学鉴定、生理生化特性测定及18S rRNA序列分析,确定其为假丝酵母菌(Candida palmioleophila)。以供试的抗草甘膦菌株总RNA为起始模板,利用Clontech公司的SMARTer技术构建cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.58×106cfu/mL,扩增后文库滴度为3.42×109cfu/mL,文库库容为2.58×106cfu,重组率为97.6%,插入片段范围为500bp~3kb,主要集中在1kb附近。表明构建的TY-JM的cDNA文库质量符合要求。     

益生菌Lactobacillus casei Zhang固态发酵培养基及发酵条件的优选

以一株分离自传统酸马奶中的益生菌Lactobacillus casei Zhang进行固态发酵(SSF),得到Lactobacillus casei Zhang的固态发酵优化培养基为豆渣6.4g、麸皮5g、蔗糖0.4g、大豆蛋白粉0.1g、碳酸钙0.5g、自来水23.2g;发酵基本条件为培养基初始pH值6.5、水分含量65%、接种量5×106cfu/g、发酵温度37℃、发酵中途(36h)补充5mL 0.01mol/L的氨水,在此条件下培养60h,发酵物中活菌数为1.65×1010cfu/g。     

阔褶水蛙皮肤组织cDNA文库的构建及抗菌肽brevinin-2LTs的eDNA克隆和序列分析

运用SMART技术成功构建了阔褶水蛙(Hylarana latouchii)皮肤组织全长cDNA文库,用来筛选抗菌肽及其他功能性基因.经鉴定,原始文库滴度为9.7×106 cfu/mL,重组率达到91%,插入片段大小在0.3～1.5 kb)范围内,文库扩增后的滴度为1.9×109 cfu/mL,说明所构建文库质量较高.通过该文库成功筛选出2个抗菌肽cDNA序列,此序列属于brevinin-2家族,因此命名为brevinin-2LT1和brevinin-2LT2.     

一株对美国白蛾高毒力苏云金芽孢杆菌的杀虫基因鉴定

美国白蛾是一种重要的检疫害虫,为进行有效地控制,筛选出了一株对其具有高毒力的苏云金芽孢杆菌。HYW-8是从黑龙江伊春市土壤中通过抗生素筛选法分离到的一株形成小菱形晶体的苏云金芽孢杆菌,利用PCR-RFLP对其基因型进行鉴定,并采用浸液法对美国白蛾进行生物活性测定。结果发现,菌株HYW-8含有cry1Ab、cry1E基因和一种未知cry2基因。生物测定结果表明,其对美国白蛾具有很高的杀虫毒力,LC_(50)为7.4×10~5芽孢/mL,低于标准菌株HD-1。因此,HYW-8对防治美国白蛾具有较强的应用潜力。     

亚洲玉米螟优良球孢白僵菌菌株的筛选

本研究选择从亚洲玉米螟和桃蛀螟僵虫中分离纯化到的5个球孢白僵菌野生菌株,进行了毒力、菌株生长速率、产孢量和孢子萌发率的测定,筛选出了两株高毒力菌株B6和B17,在108孢子/mL浓度下对亚洲玉米螟的致死率分别为95.4％和90.8％,僵虫率分别为94.4％和87.8％,LT50分别为4.4d和4.7d;其LC50分别为1.3×106孢子/mL和2.8×106孢子/mL。而且这两株菌株显现出良好的生物学特性,具有较大生产潜力。     

基于育苗措施对小省藤(Calamus gracilis)苗木生长的影响

为研究施肥和密度等措施对小省藤滕苗生长的影响,以移植后苗龄5个月小省藤实生苗作为试验材料,施肥、透光率、藤株密度、解淀粉芽孢杆菌D-B 9601-Y 2为因素,采用L9(34)正交试验设计进行苗木培育试验.结果表明:1)复合肥仅对株高生长的影响差异极显著,对地径、叶片数和叶面积生长影响差异不显著;透光率对地径和叶面积的影响差异为显著和极显著,对叶片数和株高影响不显著;株行距对各生长性状影响差异不显著;2)Y2菌株对地径和叶片生长的影响分别为显著和极显著,影响4种生长性状的主导因子各不相同,理论最佳试验组合为A2 B1 C2 D2,即施复合肥60 g,透光率25％,株行距5 cm×10 cm,Y2菌株浓度0.6×106cfu/mL,藤苗株高最高,地径最大,每株叶片数最多,叶面积最大.     

江苏省棉花黄萎病菌的培养特性及致病力分化监测

 对2008年来自江苏的37个棉花黄萎病菌菌株进行了培养特性及致病性分化监测。根据在PDA培养基上生长时形成微菌核的多少,菌株可分为3种培养类型,其中菌核型占54.1%,菌丝型占24.3%,中间型占21.6%。菌核型上升成为主要的培养类型,并且出现了初分离培养时,菌落特征为完全黑色微菌核的菌膜菌核型菌株。采用特异性引物（D-1/D-2和ND-1/ND-2）PCR检测菌株的致病类型,结果落叶型菌株占83.8%,非落叶型菌株占16.2%,显示目前江苏省棉花黄萎病菌以落叶型菌株为主,并且在每个植棉市都有分布。苗期致病力测定表明江苏省棉花黄萎病菌存在明显的致病力分化,其中致病力强的菌株占27.0%,中等的占40.5%,弱的占32.4%,并且在落叶型和非落叶型群体中都存在致病力强、中、弱的菌株。     

藏灵菇酵母菌M3耐胃肠道逆环境特性及降胆固醇的实验研究

摘 要：利用从藏灵菇中筛选的马克斯克鲁维酵母M3菌株探讨胃肠道耐受性及体外降胆固醇功效。分别在pH1.5~4.5、胆盐浓度0.3%~3.0%、NaCl浓度3.0%~6.0%的模拟胃肠道环境下,采用活菌计数法检测M3菌株的耐胃肠道逆环境特性,以邻苯二甲醛法检测其降胆固醇效果。结果表明：在pH1.5~4.5作用4h活菌数可达106cfu/ml,0.3%~3.0%胆盐及3.0%~6.0%NaCl作用8h活菌数可达105~106cfu/ml,在pH1.5~3.0(4h)及胆盐浓度0.3%~3.0%的模拟人体胃肠道环境下降胆固醇率均在60%以上。显示M3菌株具有较强的耐胃肠道逆环境特性及良好的降胆固醇能力,为开发研制降胆固醇功能食品及微生态制剂提供了实验基础。     

糜米活性乳酸菌发酵饮料加工工艺的研究

以糜米为原料,利用从内蒙古自治区传统自然发酵食品酸粥中筛选得到的具有潜在益生特性的2株乳酸菌作为菌株,研究糜米乳酸菌发酵饮料的加工工艺。结果表明,最佳的预处理条件为料水比1:20,蔗糖添加量为3.5%,复合稳定剂为黄原胶0.08%,海藻酸钠0.06%,CMC-Na0.15%,均质压力为30MPa。将发酵菌株接种到料液,接菌量为3.5%,37℃发酵8h后,制得的饮料酸甜适口,有浓郁的米香味,活菌数大于6×10~7cfu/mL。可在4℃保存28d,保质期内活菌数14d以后下降为5×10~7cfu/mL。     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解链格孢菌（Alternaria tenuissima）遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌（A. tenuissima）cDNA酵母表达文库。经检测,该文库的平均滴度为2.44×106（cfu/ml）,文库总容量为2.44×107,阳性克性率为100%,平均插入片段约为1.38kb。细极链格孢菌（A. tenuissima）cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础。     

酵素菌对温室红椒生长发育和根际土壤环境的影响

为给解决温室红椒连作障碍提供理论依据,研究了酵素菌处理对温室红椒生长发育和产量品质、根际土壤微生物群落和土壤酶活性的影响。结果表明,温室土壤中微生物群落和土壤酶活性的变化均随酵素菌处理浓度增加而增加。2%浓度的酵素菌处理效果最显著,较对照增加土壤中细菌数量1.6×106 cfu/g,增幅达1.6%;放线菌数量增加9.5×103 cfu/g,增幅达8.8%;微生物总量增加1.60×106 cfu/g,增幅达1.6%;B/F值增加1.25倍;真菌数量减少1.60×104 cfu/g,降幅达18.5%。酵素菌处理对土壤酶活性的影响趋势与土壤微生物一致。2%浓度的酵素菌处理效果最显著,其土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性分别为2.68 mg/g(NH3-N)、1.85 mg/g(Phenol)、5.25 mg/g(Glucose)和6.42 mL/g(KMnO4),较对照提高74.0%、76.2%、49.6%和32.1%。此外,酵素菌降低了红椒果实中纤维素含量,增加辣椒素、Vc、可溶性糖和可溶性蛋白含量以及产量。其中,尤以2%浓度的酵素菌处理效果最佳。因此,酵素菌处理有利于改善温室红椒根际土壤微生物群落结构,增加土壤有益微生物数量和土壤酶活性,促进红椒生长发育,改善品质并提高产量。     

中国芝麻主产区枯萎病病原菌生物学特性分析

为了鉴定中国芝麻主产区枯萎病菌,分析和比较它们的ITS序列差异和分化状况。对中国湖北、河南、安徽、江西、辽宁等芝麻主产区进行了较大范围的芝麻枯萎病病原采集和菌株分离,纯化培养得到的25个菌株进行研究,并建立了一套较成熟的芝麻枯萎病菌株分离培养纯化及保存技术。通过对25个菌株的菌落、菌核的形态特征进行了系统观察,测定了不同菌株的致病力,并对其rDNA-ITS区进行了测序。结果表明,大部分为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),有少部分为其他镰刀菌菌株。首次对中国Fusarium oxysporum感染芝麻枯萎病提供了系统的证据,25个菌株在表型和致病力等方面存在较为明显的差异,为有针对性的开展芝麻枯萎病的防治奠定了重要基础。     

3种奶牛乳房炎主要病原菌的PCR检测方法建立

奶牛乳房炎是影响奶业健康发展的一种重要细菌性疾病,迫切需要建立一种敏感、特异的检测方法,以实现奶牛乳房炎的快速、准确诊断。现根据奶牛乳房炎主要致病菌16~23S rRNA之间的序列设计引物,建立检测金黄色葡萄球菌,无乳链球菌,停乳链球菌等3种奶牛乳房炎主要致病菌的PCR检测方法。用建立好的PCR检测方法对临床患病奶牛获取的31份样品进行特异性和敏感性检测。结果显示：PCR检测方法能快速、特异地检测出3种奶牛乳房炎主要致病菌,从而确定致病菌型。对金黄色葡萄球菌,无乳链球菌,停乳链球菌的检测灵敏度分别为1×106 cfu/mL、1×106 cfu/mL、1×103 cfu/mL。因此,该方法可作为一种常规检测的替代方法。     

病犬大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测研究

摘要：为了解郑州市发病犬大肠杆菌对氨基糖苷类药物高度耐药的16S rRNA甲基化酶流行情况,本研究测定了分离自河南郑州市宠物医院发病犬的123株大肠杆菌对氨基糖苷类代表药物阿米卡星的敏感性;分别设计6种16S rRNA甲基化酶基因特异性引物,对耐药分离株进行16S rRNA甲基化酶基因PCR扩增检测。检测结果显示,在发病犬大肠杆菌中仅检测到armA和rmtB,其检出率分别为3.25%（4/123）和38.2%（47/123）。其中,有3.25%（4/123）的大肠杆菌可同时检测到armA和rmtB。这些结果提示,此地区发病犬大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因以rmtB为主。病犬细菌一旦携带这些耐药基因,可导致对氨基糖苷类药物高度耐药,应引起重视。     

长春地区鹿源性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性分析

调查吉林省长春市周边地区（榆树、农安、九台、双阳和德惠）腹泻梅花鹿源大肠杆菌的血清型分布和耐药性。对梅花鹿源大肠杆菌进行分离、培养和生化反应鉴定;并对所得菌株进行玻片凝集法确定血清型;用平板扩散法或肉汤微量稀释法测定其对15种抗菌药物的敏感性;利用PCR方法检测9种耐药基因。共得到127株大肠杆菌,84株大肠杆菌属于36种不同的血清型,其中47株属于11种血清型,即O2,O7,O9,O21,O26,O87,O126,O128,O138,O142和O154;所得菌株对15种抗菌药物呈现不同程度的耐药性;耐药基因strB、strA、aadA、tetA和sul2在被检菌株中最为流行。菌株对磺胺类和四环素耐药性最严重, 而且大多数菌株呈多重耐药性;对阿莫西林、卡那霉素较为敏感。对临床用药有指导意义。     

棉花内生拮抗菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1抗黄萎病研究

 在棉花现蕾期筛选到一个高抗黄萎病的内生菌菌株,根据16S rDNA序列同源性,将其命名为Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1(解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1)。当把该菌标记后,每株棉花施用该菌株达到1×10⁶ cfu时,该菌能顺利定殖于棉花体内。室内盆栽抗病实验表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁶,1×10⁷,1×10⁸ cfu,其在结铃期的发病株率仅为8%,5%和2%,而此时对照的发病株率高达96%。2008－2009年的小区防治结果表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁸ cfu时,2008年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为14.8%和8.5,对照分别为53.3%和26.5,2009年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为9.4%和6.5,对照为37.8%和18.8。这些结果表明,解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1对防治棉花黄萎病具有巨大的应用潜力。