不同生境Bt分离株晶体含量与靶标昆虫生物活性关系分析

通过醋酸钠-抗生素筛选法从6个不同生境中筛选得到了苏云金芽孢杆菌新菌株W14、ZY1、3346、TMQ2、B31和P91,镜检可观察到它们的伴孢晶体呈小菱形和不规则形状。SDS-PAGE分析结果表明6个菌株表达的晶体蛋白分子量为130 kDa,对其杀虫晶体蛋白的测定,结果发现这些菌株晶体蛋白含量均不高,仅为0.20%-0.29%,而B31则无晶体含量。同时对这6个Bt菌株进行了生物测定,发现所有菌株对棉铃虫杀虫活性均较低。由此可见,特殊生境获得的Bt菌株与常规菌株晶体含量不同,且晶体含量过低是其杀虫活性不高的根本原因。     

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的形成及降解

【研究目的】研究苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）伴孢晶体的形成及降解,为其生物学特性的系统研究和活性成分分析提供理论基础。【方法】将Bt菌株HD-1在牛肉膏蛋白胨固体培养基上30℃下培养24h,制成菌悬液后用日本电子JEM100-CX-II透射电子显微镜观察伴孢晶体的形成。采用五种溶解方法降解Bt菌株HD-1和LSZ9408伴孢晶体后,进行SDS-PAGE电泳。【结果】此研究的电镜观察表明Bt HD-1在分裂过程中形成芽孢和晶体,晶体为大菱形。Bt LSZ9408晶体含有130和65kDa的毒蛋白,HD-1晶体含有130、65和25kDa的毒蛋白。【结论】Bt LSZ9408和HD-1伴孢晶体都包含CryI和CryII蛋白质毒素。     

两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定

发掘对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株和杀虫蛋白基因在生物防治中日益受到人们的重视。利用杀鞘翅目Bt基因通用引物进行PCR检测与生物测定相结合的方法,从山东省各地土壤中分离的66株Bt中筛选获得了两株对鞘翅目昆虫具有杀虫活性的菌株B-DLL和B-JJX,并采用SDS-PAGE和PCR-RFLP方法对其杀虫晶体蛋白和杀虫基因类型进行了鉴定。结果表明,菌株B-DLL和B-JJX对华北大黑鳃金龟1龄幼虫14 d的校正死亡率分别为86.7%和60.0%,对暗黑鳃金龟1龄幼虫14 d的校正死亡率分别为83.3%和76.7%,对柳蓝叶甲3龄幼虫5 d的校正死亡率分别为33.3%和46.7%。菌株B-DLL的伴孢晶体呈圆形,B-JJX的晶体为近方形,两株Bt的伴孢晶体主要为130 kDa的蛋白,两株Bt均含有新的cry8类基因,而不含cry1、cry2、cry3、cry4/10和cry7等基因。     

玫烟色拟青霉Pf9606菌株的紫外诱变选育

摘要：采用紫外照射孢子悬液和原生质体的方法对玫烟色拟青霉Pf9606菌株进行了诱变选育,并对诱变株的生物学性状及毒力进行了测定。结果表明：筛选出的 UV-22、UVP-39两菌株的产孢量分别为对照的1.58倍和1.37倍,毒力分别比对照的提高14.03%和11.00%。比较UV-22和UVP-39两诱变菌株可知,玫烟色拟青霉PF9606孢子悬液的诱变效果要好于原生质体的诱变效果。     

产类黄酮链霉菌的紫外线诱变选育

诱变选育高产类黄酮链霉菌菌株,采用不同强度的紫外线对出发菌株链霉菌HNS2-2单孢子悬液诱变处理。以出发菌株作为对照,分光光度法测定诱变菌株发酵产物黄酮类物质含量为评价指标,进行反复筛选。在20 W紫外灯、辐射距离30 cm、照射20 s条件下,获得高产菌株251,其黄酮类物质产量达41.87μg/mL,比出发菌株提高15.52%,且连续7次传代稳定性能稳定。通过紫外诱变选育的方法,能提高出发菌株黄酮类物质产量。     

苏云金杆菌HB菌株生物学特性初探

苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)BtHB菌株是从736株野生型Bt菌中筛选分离的1株对仓库害虫烟草粉螟具有高效杀虫活性的菌株。BtHB菌株与已知标准菌株生理生化特性比较,初步确定BtHB菌株为加拿大亚种(canadensis,H5a5c)。对BtHB菌株进行发酵条件筛选结果表明,BtHB菌株的最适培养时间、温度、酸碱度、转速分别为36h、30℃、pH7.5、180r/mim。BtHB菌株对烟草粉螟二龄幼虫的室内防治效果9d后发酵原粉稀释100、300、600倍的防效超过80%。BtHB菌株伴孢晶体蛋白质提纯在电镜下观察发现,BtHB菌株晶体有菱形、长椭圆形、不规则形晶体,晶体大小不同,长椭圆形晶体长轴平均1.59μm,短轴平均0.79μm,菱形晶体长轴平均1.60μm,短轴平均0.81μm。     

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株杀虫晶体蛋白基因分析

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株是从黑龙江采集的土样中分离获得的新菌株,对其伴孢晶体形状、基因型、蛋白表达以及杀虫活性进行了系统研究.菌株SHJ-5产生的伴孢晶体形状为钝菱形;利用PCR-RFLP技术对该菌株的基因型进行鉴定,结果表明,该菌株含有cry1Aa、cry1Ea、cry1Be、cry1Ah、cry1Ai、cry2...     

多位点生物杀虫毒素BtA害虫敏感性的研究

多位点生物杀虫毒素BtA是通过氨基-羧基偶联剂EDC将两种生物毒素[Bacillus thuringiensis（Bt）晶体原毒素和阿维菌素]进行键合反应，形成的具有多个作用位点的生物藕合产物。通过研究小菜蛾（Plutella xylostella L.）对BtA敏感性的消减和恢复，以及不同地域小菜蛾对其敏感性的差异，来初步评估多位点生物杀虫毒素BtA害虫敏感性变化的规律。试验结果表明：小菜蛾室内相对敏感种群对BtA以及它的反应底物Bt伴胞晶体和阿维菌素的敏感性稳定（LC50为0.0004~0.0020mg/ml）。在三种生物杀虫剂的选择压力之下小菜蛾敏感性下降，2代后对BtA抗性比的增长（2.29）显著地低于Bt伴胞晶体(8.35)和阿维菌素(22.5)。小菜蛾田间种群在脱离杀虫剂的选择压力后敏感性会增加，2代后对BtA的敏感性显著地增加了4.7倍，高于对Bt伴胞晶体的1.28倍和对阿维菌素的2.00倍。福建省七个地市小菜蛾表现出敏感性的多态性，对BtA、Bt伴胞晶体和阿维菌素的抗性比分别为1.18~6.85、1.22~23.93和1.58~4.77。聚类分析结果在福建省以中部地区的小菜蛾具有相对较低水平的敏感性。说明多位点生物杀虫毒素BtA有助于延缓抗性的产生、降低抗性和迅速恢复害虫敏感性的作用。     

对铜绿丽金龟幼虫有活性的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定

为了发掘新的斑资源,从3种不同土壤类型的样品中分离得到了285株苏云金芽孢杆菌菌株。采用杀虫活性测定方法从中获得了13株对铜绿丽金龟幼虫具有高毒力的菌株。利用PCR—RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析法,研究了这13株苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因类型和晶体蛋白表达情况。结果显示,有12株均含有编码毒杀铜绿丽金龟幼虫毒素蛋白的cry8Ca基因,而FTL53没有鉴定到已有的基因类型。这13株菌的伴孢晶体都含有分子量为130kDa的蛋白。本研究为不断发现新型的、具有高毒力的cry毒素基因奠定了基础。     

Cry1Ac毒素突变体的构建、表达及杀虫活性测定

为了构建对敏感和类钙粘蛋白突变的抗性昆虫都具有高杀虫活性的毒素,将Cry1Ac毒素结构域I中α1和α2之间插入一个α胰凝乳蛋白酶作用位点,并分析突变体毒素在苏云金芽孢杆菌中形成伴孢晶体、目标蛋白的表达情况,以及鉴定突变体毒素的杀虫活性。结果发现:4个突变体蛋白都能在苏云金芽孢杆菌中表达产生约130 k Da的目标蛋白,但不能形成有规则的伴孢晶体。这可能是由于突变体蛋白在Bt生长的平稳期达到最高,在衰亡期开始被降解造成的。4个突变体中,Cry1Acm4在培养48 h时产量最高,而且其对甜菜夜蛾杀虫活性比野生型高1.6倍,但是其产量只有野生型毒素产量的十分之一。尽管由于Cry1Acm4的表达量较低而使其实际应用的价值不大,但这种构建突变体的方法对研究高毒力的Cry1Ac毒素提供一种新的思路。     

一株苏云金芽孢杆菌的分离与杀虫基因的鉴定

采用温度筛选从云南省刁苓山土壤中分离得到一株伴孢晶体为长菱形的苏云金芽孢杆菌BSH-1。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE对菌株所含cry基因类型和晶体蛋白的构成进行鉴定、分析,结果表明:菌株BSH-1具有的cry基因组合为:cry1Aa,cry1Ac,cry1Db,cry2Ab,cry1Ia,表达的晶体蛋白有130,70和56 kDa 3种,该蛋白对甜菜夜蛾具有较高杀虫活性,LC50为1.43 ng/mg。该菌株的基因组合类型对构建杀虫基因工程菌具有重要参考价值。     

高产蛋白酶的纳豆杆菌菌种选育

以纳豆杆菌为出发菌株,进行紫外诱变,采用玉米蛋白粉为底物的平板分离法初筛及摇瓶发酵玉米蛋白粉复筛的筛选策略,以复筛发酵物中可溶性蛋白含量和抗氧化活力为指标进行筛选。结果表明,菌悬液在照射时间180 s,菌浓度为1×105个/mL下,突变株的浓醪玉米蛋白粉发酵液的可溶性蛋白质量浓度为(12.74±0.12)mg/mL,抗氧化活力达到(725.70±13.23)U/mL,突变株遗传性能稳定。     

新型Bt杀虫蛋白:VIP杀虫的机理与植物转基因应用

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中最主要是杀虫晶体蛋（insecticidal crystal proteins,ICP）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein,VIP）。VIP在励营养期生长阶段开始分泌,它们不形成蛋白晶体,和ICP在进化上没有同源性。VIP的杀虫活性很高,达到了纳克级水平,为一类新型杀虫蛋白,被认为是第二代生物杀虫剂。VIP根据蛋白质序列同源性主要分为三类：VIP1、VIP2和VIP3。VIP1和VIP2共同构成二元毒素对鞘翅目萤叶甲科昆虫具有特异性毒杀作用,VIP3对鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性。由于VIP对一些可能对ICP产生抗性的害虫具有高效的毒杀作用,而且害虫对ICP和VIP产生交互抗性的几率也很小,因此转VIP植物研究受到了科学家的青睐,并已有不少成功的报道和专利。目前为止,已经利用VIP3构建了转基因水稻、转基因玉米、转基因棉花等多种转基因作物。     

聚乙烯醇(PVA)降解菌1-21的筛选及鉴定

摘要：聚乙烯醇（以下简称PVA）废水污染严重,生物方法降解PVA可显著降低处理废水的成本,因此筛选高效PVA降解菌对PVA废水的治理十分重要。采集的土壤样品经85℃水浴及富集培养,并采用I2-KI及硼酸染色法进行初筛,初筛选到PVA降解菌9株,初筛菌株经摇瓶发酵培养并对其发酵液进行PVA降解酶酶活力测定,复筛得到4株PVA降解酶酶活力较高的菌株,其中菌株1-21的酶活最高为1.136 U/mL,通过对该菌株形态学观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株属于为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,与相应标准菌株BCRC 11601的16s RNA序列相似度达99.77%,为用生物方法高效处理PVA废水提供优势菌株。     

转Bt基因棉Bt蛋白的亚细胞结构定位

为了探明Bt棉晶体蛋白在细胞中定位的特异性,揭示Bt棉抗虫稳定性,以转Bt基因棉GK-12为试材,采用免疫细胞定位的方法,在亚细胞结构水平上研究Bt蛋白的定位取向。结果表明,Bt蛋白主要分布在细胞质和细胞壁间隙中,并且,在细胞质中的分布密度高于细胞壁间隙;在细胞质中,晶体蛋白主要分布在细胞膜、内质网、叶绿体和前质体上,并且在叶绿体和前质体上面高密度集中分布。说明转Bt基因棉GK-12叶肉细胞中,外源晶体毒蛋白的定位取向于惰性细胞器—叶绿体及其前体。     

诱变育种提高乳酸乳球菌Lactococcus lactis产Nisin的能力

为了获得高产细菌素的乳酸乳球菌菌株,通过采用紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES)诱变和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变的方法,获得多株诱变菌株,研究突变株代谢生产Nisin的效价及抑菌能力。结果表明,其中通过诱变得到了一株高产菌株DU101,该菌株代谢生产Nisin的效价由442 IU/m L提高到了1386 IU/m L,约是原始菌株HDBR-06的3.14倍。通过传代试验验证了菌株的遗传性能稳定。     

苏云金芽孢杆菌及其在动物疾病防治上的应用

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种自然界广泛分布的好气芽孢杆菌,由于对昆虫具有特异性毒杀作用,不污染环境和对人畜无害,成为目前应用最广、产量最大的生物杀虫剂菌种。近几年来,Bt在其它领域也发挥了巨大作用。本文将从Bt微生物学、Bt在动物疾病防治中的应用等方面作一综述。     

大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的棉花黄萎病,是一种危害严重的世界性病害。通过初筛和复筛得到了对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的细菌菌株12-51,通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA全序列分析,最终鉴定此菌株为Bacillus velezensis,16S rDNA序列相似度达99.74%。采用有机溶剂萃取和盐析法对发酵产物进行了提取,初步断定拮抗物质为蛋白类。通过对粗蛋白进行进一步研究发现,60%组分活性较高,并且对热以及酸碱敏感性较小。试验结果为棉花黄萎病的生物防治奠定了基础。