小麦ATG8的原核表达及其抗血清制备

提取小麦品种L10的总RNA,进行反转录,其产物用于探究自噬基因ATG8的生物学功能.用PCR方法克隆ATG8,将克隆的ATG8亚克隆至表达载体PMD19-T,酶切后切胶回收,然后把产物测序鉴定,转化宿主菌E.coli Rosetta-gami B(DE3),构建原核表达系统,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,然后利用Western Blotting技术对兔抗血清进行检测,鉴定了该抗血清的结合特异性.ATG8抗体的成功制备,为小麦中ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础.     

草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应

为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。     

过表达细胞自噬基因ATG8f对植物响应镉胁迫的影响

自噬是广泛存在于真核细胞中对损伤的细胞器和长寿命蛋白进行降解的一条途径。随着近几年工业发展的快速兴起,重金属引发的环境污染和生物健康问题引起了人们的关注。细胞自噬响应逆境胁迫,但是过表达自噬基因对耐受重金属胁迫的影响及作用机理还不清楚。本实验用不同浓度的镉处理野生型Col和ATG8f过表达拟南芥,分析其根长及叶绿素含量差异,从而了解细胞自噬和重金属镉胁迫之间的关系。结果表明:过表达ATG8f基因增加了植物对镉胁迫的敏感性。     

非生物胁迫下黄瓜(Cucumis sativus)四个自噬基因的表达及生物信息学分析

自噬是一种存在于真核生物中进化保守的分解代谢过程,在植物处于逆境胁迫以及生长发育受阻时起到至关重要的作用。通过水杨酸诱导,从黄瓜中分离出四个自噬基因:ATG8C1、ATG8C2、ATG8F、ATG8C,为揭示这些自噬基因在非生物胁迫下的作用,本研究选取黄瓜幼苗为试材,分别进行以下激素和胁迫处理,并用qRT-PCR检测基因的表达:(1)用10 mmol/L SA和0.2%MeJA滴加叶片进行激素诱导处理,于0 h、6 h、9 h和24 h在滴加的位置取材;(2)用200 mmol/L NaCl进行盐胁迫处理,用20%PEG6000进行干旱胁迫处理,于0 h、6 h和24 h取黄瓜幼苗的根、茎和叶;(3)用黑暗进行碳饥饿处理,于0 h、6 h和24 h取黄瓜幼苗的根、茎和叶。结果表明,在SA和Me JA处理下,黄瓜四个自噬基因都呈现上调表达;在盐和干旱处理下,四个自噬基因的表达有所不同,在黄瓜根和叶中基本呈现上调表达,在茎中多数呈现下调表达。在碳饥饿处理下,四个自噬基因呈现大幅度上调表达。该结果说明在不同的胁迫下,自噬的发生途径有所不同。本研究还利用ExPasy在线工具ProParam和ProtScale分析了四个自噬蛋白的氨基酸、理论分子量和等电点等理化参数,利用MEGA5软件建立了系统进化树,对四个自噬基因进行了初步的生物信息学分析。通过以上试验可以为进一步研究黄瓜自噬基因参与植物抗逆胁迫提供分子生物学的理论基础。     

李发强教授研究团队首次揭示植物细胞自噬新途径

<正>日前,《The Plant Cell》在线发表了华南农业大学生命科学学院李发强教授研究团队的研究论文,首次揭示了一种新的不依赖于ATG1蛋白激酶复合体的植物细胞自噬途径。在此之前,ATG1蛋白激酶复合体一直被认为是激活植物细胞自噬途径必不可少的组分。植物细胞自噬是一种通过脂膜包裹自身细胞质蛋白或细胞器,并将其运     

小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达

细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦158⁷中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDV AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。     

大豆GmLCL2蛋白的多克隆抗体制备

大豆(Glycine max L.)是典型的短日照植物,光周期反应对开花至关重要. GmLCL2 可能是大豆生物钟中的生物振荡器关键基因.为进一步研究 GmLCL2 基因的功能及与其他生物钟基因的相互作用,本试验克隆了 GmLCL2 的特异片段,制备了多克隆抗体并对细菌及大豆不同组织进行了免疫印迹检测.试验结果表明,多克隆抗体效价为1∶ 2000,并且在大豆不同组织(上胚轴、下胚轴、根、茎尖生长点和叶片)中均检测到GmLCL2蛋白的特异表达.获得的GmLCL2多克隆抗体效价较好,特异性较强,为后续GmLCL2功能研究提供良好探针.     

赤羽病病毒单克隆抗体的制备及c-ELISA抗体检测方法建立

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合,以获得抗AKV的单克隆抗体;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原,山羊抗鼠HRP-IgG为二抗,建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应,与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应;建立的检测AKV抗体ELISA检测方法,诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比,1∶50血清稀释比,1∶2 000二抗稀释比,封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性,小于44%为阴性;所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系,建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体,为进一步开展AKV抗体...     

中国农科院植保所揭示细胞核自噬介导的病毒蛋白降解机制

<正>近日,中国农业科学院植物保护研究所作物有害生物功能基因组研究创新团队在《New Phytologist》在线发表研究论文,该论文发现了植物中的一种新型细胞核自噬能够降解病毒蛋白进而抑制病毒的复制和侵染的机制。细胞自噬是细胞质中进化保守的降解途径,已成为对抗入侵病原物的重     

中国农业科学院植保所揭示稻瘟病菌致病新机制

<正>蛋白精氨酸甲基转移酶调节包括细胞自噬在内的多种生物学过程。然而,PRMTs在细胞自噬形成过程中具体分子机制目前尚不清楚。近日,中国农业科学院植保所作物有害生物功能基因组研究创新团队在国际著名学术期刊《New Phytologist》上在线发表研究论文,报道了蛋白精氨酸甲基转移酶Mo HMT1在稻瘟病菌中调节细胞自噬的分子机制。     

小麦NIP蛋白的生物信息学分析

为了探讨小麦NIP蛋白的结构特征和性质差异,本研究通过生物信息学手段,鉴定了两条新的小麦NIP蛋白,并和两条已知的小麦NIP蛋白一起,进行了蛋白质氨基酸序列比对、基序、二级结构、跨膜结构以及亚细胞定位等相关分析。发现两条新的小麦NIP蛋白TaNIP1-2、TaNIP4-1,与已知的TaNIP2-1-LIKE、TaNIP2-2一样,均为脂溶性蛋白,且都具有6个跨膜结构域、N-末端和C-末端位于膜内等MIP蛋白结构共性。亚细胞定位分析结果表明,除TaNIP4-1定位于质膜外,其他3个小麦NIP蛋白均定位于内质网。Motif分析结果显示,除都含有MIP基序外,TaNIP1-2还含有BCHF基序和DUF 2 157基序。磷酸化位点预测分析结果显示,4个小麦NIP蛋白都未预测到磷酸化位点。本研究可为小麦NIP蛋白亚家族的研究和利用提供理论参考及分析依据。     

中国农科院揭示植物RNA病毒利用UPR-细胞自噬促进病毒侵染的新机制

正近日,中国农业科学院植物保护研究所作物有害生物功能基因组研究创新团队通过研究发现芜菁花叶病毒(TuMV)能够激活非折叠蛋白响应途径(UPR)介导的细胞自噬,并招募UPR-细胞自噬-液泡膜相关因子促进病毒的复制和侵染,相关研究成果发表在《新植物学家(New Phytologist)》上。马铃薯Y病毒科病毒是世界种类最多、危害最为严重的植物RNA病毒     

小麦VQ家族全基因组鉴定与表达分析

近年来,VQ蛋白因发现与WRKY转录因子相互作用而引起广泛关注。目前,关于VQ基因家族在小麦中的研究鲜有报道。为了解小麦VQ基因的存在数量和结构等特征,本研究采用生物信息学技术在小麦基因组中鉴定了25个小麦VQ基因,并对其编码蛋白的结构、性质、亚细胞定位和进化关系进行了分析。结果表明,大多数小麦VQ蛋白序列较短,为中性或偏碱性蛋白,由单外显子基因编码;小麦VQ蛋白主要分布于细胞核中。25个VQ基因不均匀地分布在21条小麦染色体上,片段复制是小麦VQ基因家族的主要扩张方式。通过基因表达模式分析,发现部分小麦VQ基因响应干旱和高温的胁迫,并呈组织表达特异性。研究结果为进一步分析该家族成员,并深入探讨其在小麦中的生物学功能和进化模式奠定了基础。     

棉花黄萎菌间接ELISA方法的建立及其检测棉花体内带茵的应用

利用棉花黄萎病的病原菌的菌丝蛋白作为抗原,制备了该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体,建立了特异性检测棉花黄萎病菌的间接ELISA方法.该方法检测灵敏度达到5 ng/mL棉花黄萎菌菌丝蛋白.应用该方法可定量检测棉花组织及其根部土壤中棉花黄萎菌的含量,同时发现病株的茎、根及根部土壤的带菌量多少与病株发病程度有一定的相关性.本研究说明,该方法可在棉花黄萎病的早期检测和预报上具有重要的应用前景.     

α-苦瓜素蛋白的原核表达及其抗体制备

α-苦瓜素是一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有多种生物活性,有着广泛的应用前景。本研究通过原核表达技术成功获得α-苦瓜素蛋白及制备了血清抗体。首先通过RT-PCR方法从苦瓜籽中克隆到α-苦瓜素全长基因,然后将该基因连接至原核表达载体p ET-28a(+)上,导入大肠杆菌Rosetta菌株中并少量诱导表达,筛选出重组蛋白的最适表达条件。在37℃、终浓度1 mmol/L IPTG的诱导条件下,可成功诱导出分子量约为29.7 k D左右的可溶性重组蛋白,与预期α-苦瓜素大小一致。按照最适条件进行大量诱导α-苦瓜素蛋白的表达,利用Ni-NTA柱对α-苦瓜素重组蛋白进行纯化,最后以纯化的α-苦瓜素蛋白免疫注射新西兰大白兔制备抗血清。Western blotting分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测苦瓜籽中的α-苦瓜素蛋白。本研究结果为下一步探究α-苦瓜素调控植物防御生物胁迫的分子机理提供指导。     

科技与产品

正南京农大与加农业与农业食品部合作在植物细胞自噬研究取得新进展细胞自噬(autophagy)一词来自希腊单词auto-,意思是"自己的",以及phagein,意思是"吃"。所以,细胞自噬的意思就是"吃掉自己"。细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程,该过程中一些损坏     

植物病原体中自噬作用的研究进展

自噬是真核生物细胞中大分子物质降解过程。研究表明自噬在病原体侵染中起重要作用,自噬缺失导致病原体形态异常,包括分生孢子形成和发育,有性繁殖及附孢形成和膨压产生等,同时侵染力降低,且不同病原体自噬类型不同。本研究归纳了自噬在稻瘟病菌、炭疽病菌、禾谷镰孢菌等植物病原体中的作用,分析了自噬缺失与侵染缺陷之间的关系,推测自噬的缺失导致了营养循环失衡,影响病菌的生理,进而导致侵染异常。今后的研究可侧重于病原体自噬的分子机制、线粒体自噬以及自噬在病原体与宿主互作中的作用。     

紫粒小麦高原115中R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4A的克隆及功能分析

花青素在小麦生长发育中参与多种生理生化过程,关于花青素合成机理已被深入研究。本研究利用同源克隆从紫粒小麦高原115中克隆到Ta MYB3-4A基因。Ta MYB3-4A基因组为序列为853 bp,其完整开放阅读框序列为729 bp,含有一个124 bp的内含子;编码蛋白为242个氨基酸,具有典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB蛋白。利用不同的MYB蛋白构建系统发育树,Ta MYB3-4A编码蛋白与调控花青素合成的MYB蛋白聚为一类。Ta MYB3-4A与b HLH基因共同瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。不同组织特异性表达分析,Ta MYB3-4A基因在高原115胚芽鞘和种皮中表达量高,茎中次之,叶片和颖壳中表达量弱,但在根中并未检测到。研究表明Ta MYB3-4A基因编码蛋白为R2R3-MYB转录因子,调控小麦高原115不同组织中花青素生物合成。     

香蕉ATG8g过表达植株的获得及启动子元件分析

为研究自噬相关基因ATG8g在香蕉中的潜在功能,以及在过表达植株中对植株形态发育的影响,本研究通过农杆菌转化法获得MaATG8g拟南芥过表达植株。结果发现,MaATG8g对植株的外观形态不产生影响。同时将MaATG8g启动子连入pGreenⅡ0800-LUC载体,并对MaATG8g启动子序列分析,发现该启动子片段含有生长素应答元件、脱落酸响应元件、抗氧化反应元件、低温胁迫相关元件、水杨酸响应元件、赤霉素应答元件和其他逆境响应相关的顺式作用元件,推测目的基因具有胁迫相关性,可以进一步研究MaATG8g胁迫相关的生物学功能。