巴西橡胶树K+通道蛋白HbKCO1的原核表达

K+通道蛋白在维持细胞离子平衡等生命活动中发挥重要的作用。利用真核或原核表达系统高效表达K+通道蛋白是深入研究其生化特征及生理功能的基础和前提。本研究在成功克隆巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因cDNA全长的基础上,将HbKCO1 cDNA 编码区插入pET-28a构建原核表达载体pET-28a(+)-HbKCO1,并分别转化大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS和BL21(DE3)菌株。经过条件优化,转化的大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS菌株经1mM IPTG诱导3h能够高效表达HbKCO1重组蛋白,但同等条件下转化的BL21(DE3)菌株仅能微量表达。HbKCO1重组蛋白原核表达具有菌株依赖性。     

水稻金属硫蛋白OsMT-1-2a的原核表达及活性分析

本研究旨在研究水稻金属硫蛋白Os MT-1-2a基因原核表达情况及清除活性氧的能力。从水稻中克隆获得的Os MT-1-2a基因亚克隆至p ET32a原核表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了带有6x His标签的Os MT-1-2a全长重组蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在,分子量大小为32 k D,与预期大小一致。随后,通过镍柱法纯化目的蛋白,利用WST法表明纯化蛋白在体外具有一定的清除超氧化物的能力。     

APEC毒力基因ygeG的原核表达载体构建、表达纯化及鉴定

兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。     

棉花去泛素化酶基因GhOTUD5原核表达条件的优化

棉花组蛋白去泛素化酶GhOTUD5与生殖发育密切相关。为了获得大量可溶性表达的GhOTUD5蛋白,本试验对目的蛋白原核表达条件进行优化。采用分子克隆方法构建重组表达载体pET-22b-GhOTUD5,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和Transetta(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导目的蛋白表达。在对影响原核表达的四个单因素(菌体密度OD600,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间和诱导温度)分别分析的基础上,设计三水平的正交试验L9(43),摸索大量可溶性目的蛋白表达的最优条件。结果显示,目的蛋白GhOTUD5在Transetta(DE3)中成功表达,在BL21(DE3)中不表达。在菌体密度OD600为0.8、诱导温度为28℃、IPTG终浓度为0.7 mmol/L、诱导3 h的条件下可溶性目的蛋白表达量最高,达到13%左右。该研究结果为进一步研究GhOTUD5在棉花育性方面的功能提供了科学数据。     

海南龙血树金属硫蛋白基因DcMT3a和DcMT3b的鉴定和表达分析

植物金属硫蛋白通过清除活性氧参与了植物防御反应,是植物胁迫应答的关键蛋白。MT3蛋白是重要的植物金属硫蛋白之一。本研究在对海南龙血树转录组序列进行注释拼接的基础上,利用RT-PCR技术首次克隆了2个DcMT3基因,分别命名为DcMT3a和DcMT3b,GeneBank登录号分别为MF594216和MF594217。结果表明DcMT3a和DcMT3b基因分别编码65个和62个氨基酸,且均具有植物MT3蛋白的典型结构特征,即N端的4个保守性半胱氨酸(cysteine,C)和C端的6个保守性半胱氨酸。进化分析表明DcMT3a和DcMT3b与百合目植物芦笋、马蔺具有较高相似度。亚细胞定位分析发现2个DcMT3蛋白均定位于叶绿体,二级结构也都主要由α螺旋和无规则卷曲构成。表达分析表明DcMT3a和DcMT3b在海南龙血树各组织中具有不同程度的表达,其中果实中的表达量最高。此结果为深入研究植物金属硫蛋白在海南龙血树发育及血竭形成过程中的作用奠定了基础。     

海南龙血树金属硫蛋白基因DcMT2的克隆和表达分析

金属硫蛋白是植物金属离子代谢及胁迫应答的关键蛋白,而且通过清除多余的活性氧调控着植物抗性的形成过程。MT2蛋白是重要的植物金属硫蛋白之一。本研究利用海南龙血树转录组数据,在注释拼接的基础上首次克隆了海南龙血树金属硫蛋白MT2基因(命名为DcMT2,Gene Bank登录号为MF594215),DcMT2基因序列全长为237 bp,编码79个氨基酸。序列分析发现DcMT2具有典型的植物金属硫蛋白MT2的结构特征,包含2个富含半胱氨酸的保守基序。DcMT2蛋白与百合目植物芦笋、水仙和马蔺具有较高的相似度,且在系统进化上划为同一分支。生物信息学分析显示该编码蛋白包含6个磷酸化位点,为非分泌型蛋白,主要在细胞外发挥作用,相对分子量为7.81 kD,理论等电点为4.86;二级结构主要由α螺旋(20.25%)和无规则卷曲(56.96%)构成。实时荧光定量PCR结果表明,DcMT2在海南龙血树的各组织中均有表达,在果实中的表达量最高,而根、茎、叶中的表达量较低。此结果为研究金属硫蛋白DcMT2在海南龙血树发育和血竭形成过程中的作用奠定了基础。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

三角褐指藻F-box like蛋白基因的原核表达及蛋白纯化

F-box蛋白是SCF复合体的重要组成元件之一,能通过泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system, UPS)参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程。为了探究一个F-box like蛋白在三角褐指藻细胞周期调控过程中的作用机制,本研究从三角褐指藻中克隆得到一个F-box like蛋白基因,构建原核表达载体Tph-pET28a-F-box,将其转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中诱导表达,并对其诱导表达条件进行了优化,最后使用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)对重组蛋白进行纯化并进行了生物信息学分析。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测。结果显示,导入大肠杆菌BL21 (DE3)的三角褐指藻F-box like蛋白基因能够被诱导表达,重组可溶性蛋白最佳诱导条件为16℃时,以浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导12 h,纯化后的蛋白通过Western blot鉴定,显示在相对分子质量约为72.75 kD处出现一条与预期大小相符的蛋白印迹条带。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有F-box蛋白的典型特征,位于膜外且不含有跨膜结构域,为亲水性蛋白,α-螺旋和无规卷曲为三角褐指藻F-box蛋白二级结构的主要组成元件。本研究为进一步研究三角褐指藻F-box like蛋白的作用机制奠定了基础。     

参薯金属硫蛋白基因DaMT2a的克隆与表达分析

金属硫蛋白属于一类富含半胱氨酸,能够与重金属离子结合的低分子量蛋白质,在植物抗逆过程中起着重要作用。本研究从参薯中克隆了一个金属硫蛋白基因,命名为DaMT2a (与金属硫蛋白MT2a同源),序列分析显示克隆获得的金属硫蛋白基因的c DNA长度为540 bp,包含了3个外显子和2个内含子,编码79个氨基酸,具有金属硫蛋白基因家族的保守结构域。进化树分析表明DaMT2a属于金属硫蛋白Type2类成员。利用实时荧光定量PCR技术研究了其在正常组织及胁迫条件下的表达特性。结果表明DaMT2a主要在参薯的茎和雄花中大量表达,机械伤害可显著上调DaMT2a基因表达,高温处理则明显下调DaMT2a基因表达,乙烯利和脱落酸处理上调DaMT2a基因的表达。本研究为参薯抗逆相关金属硫蛋白基因的筛选和功能鉴定提供了参考依据。     

鸭梨PbChiⅡ的克隆与表达分析

为明确几丁质酶在鸭梨抗病过程中的作用,以鸭梨为试材,提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆几丁质酶基因PbChiⅡ,分析PbChiⅡ在梨黑星病菌诱导下的表达模式,构建原核表达载体pET30a-PbChiⅡ,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达PbChiⅡ蛋白,分析重组蛋白在非生物胁迫下的生长能力。结果表明:PbChiⅡ基因全长(基因登录号:KP876485)969bp,实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析显示,PbChiⅡ基因的表达受病原菌的调控,在供试的96h内,梨黑星病菌可诱导该基因表达,且表达量在48h达到最高。将PbChiⅡ基因成功克隆到原核表达载体pET30a上,SDS-PAGE分析表明,该重组蛋白在37℃,1.0mmol/LIPTG诱导2h,表达量最大。转pET30a-PbChiⅡ载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了分子量约35.53kDa的重组蛋白。诱导的蛋白可增强菌体在NaCl、CuCl_2、CdCl_2和ZnSO_4等非生物胁迫下的生长能力。为进一步探索PbChiⅡ基因的功能提供了基础资料。     

铝胁迫对烟草叶片光能利用、光保护系统及活性氧代谢的影响

为了揭示烟草叶片光能利用和光保护系统在铝诱导的活性氧代谢中的作用机理,以2个不同耐铝性的烟草品种云烟100(耐铝)和云烟105(敏感)为材料,采用水培法研究了不同铝浓度(0,50,100,200μmol/L)对烟草植株生长、叶片活性氧含量、光合特性、叶绿素荧光参数、光呼吸、超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响。结果表明,铝浓度的升高显著降低了烟草叶片叶绿素含量、净光合速率(Pn)、最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ光合电子传递量子效率(ΦPSⅡ)和光化学猝灭系数(q P),提高了反应中心PSⅡ过剩激发能,从而导致叶片O_2-·和H2O_2含量升高,植株生物量下降,其中对云烟105影响大于云烟100。随铝处理浓度的升高,烟草叶片非光化学猝灭系数(NPQ)、光呼吸速率、SOD和APX活性呈先升后降的趋势。与敏感品种云烟105相比,耐铝品种云烟100在不同铝浓度胁迫下表现出更高的ΦPSⅡ、q P、NPQ、光呼吸速率以及SOD和APX活性,说明低浓度铝胁迫下烟草叶片可通过提高光化学反应能力、热耗散、光呼吸以及抗氧化酶活性等途径来降低反应中心PSⅡ过剩激发能,防止或清除活性氧的积累,从而增强其对铝的耐性。     

低温胁迫下水杨酸预处理对茉莉幼苗活性氧及保护酶的影响

【研究目的】为探讨水杨酸(Salicylic acid,SA)预处理对低温胁迫下茉莉(Jasminun Sambac L. Ait)幼苗的影响;【方法】采用叶面喷施不同浓度SA的方法,测定了单、双瓣茉莉经SA预处理后在低温胁迫下存活率、活性氧、保护酶和细胞膜方面的变化。【结果】结果表明,茉莉幼苗经SA预处理后在低温胁迫下存活率有效提高,相对电导率、超氧阴离子(O2-)产生速率、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量显著下降,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性显著提高。最适合提高单、双瓣茉莉耐寒性的SA预处理浓度分别为1.25mmol/L和0.75mmol/L。【结论】这表明SA可通过减轻活性氧积累,提高保护酶活性,保护膜结构和功能,有效缓解低温胁迫对茉莉幼苗的伤害     

棉花抗坏血酸过氧化物酶基因GhAPX的克隆及耐冷性初步鉴定

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是活性氧H2O2的清除剂,对抵抗植物逆境发挥着重要的作用。为了探究棉花APX基因的耐冷功能,本实验应用RT-PCR和RACE技术从苗期耐冷型棉花品种‘新陆早25号’叶片中克隆得到一个APX基因GhAPX,并对转基因烟草的主要抗氧化酶活性和快速荧光参数进行了分析。结果表明,该基因c DNA全长1763 bp,开放阅读框1137 bp,编码379个氨基酸。Blastx比对表明该基因与已克隆的棉花气孔APX相似性最高,达99%。进化分析表明该基因与刚毛怪柳关系较近,与拟南芥(AtAPX)和小麦(TaAPX)关系较远。蛋白质结构分析显示该基因属于植物过氧化物酶基因家族,亚细胞定位结果显示该蛋白位于叶绿体中。实验成功构建了植物表达载体PZP35S-GhAPX。转基因研究发现,转GhAPX基因会提高烟草的POD和CAT活性。在4℃冷害条件下,转基因烟草的POD和CAT活性及Fv/Fm和pI均大于野生(对照)株,且下降幅度和速度均小于野生植株,而SOD活性在转基因和野生植株间差异不大,初步推测GhAPX基因可以提高棉花幼苗的低温冷害抵抗力。本研究为揭示GhAPX基因的功能及其与棉花耐冷性的关系提供了理论参考。     

水杨酸对节节麦根在水分亏缺下氧化与抗氧化反应的影响

研究分析了水杨酸(SA)对20％聚乙二醇6000(PEG6000)引起节节麦幼苗根中活性氧(ROS)水平和抗氧化酶活性的影响,结果发现,PEG能够显著提高节节麦根中超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的含量,明显降低超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性;SA能明显抑制PEG诱导的MDA和O2-的积累,缓解PEG对SOD、GR和CAT活性的抑制作用,但对APX的活性没有明显影响。这表明SA可能主要通过影响SOD、GR和CAT的活性缓解了水分亏缺对节节麦造成的伤害。     

利用表达分析和基因沉默方法研究硫代硫酸硫转移酶基因TaTST与小麦抗白粉病反应的关系

硫代硫酸硫转移酶参与植物体内的硫代谢、氰化物的清除以及活性氧的生成与清除,与植物抗病反应密切相关。小麦抗、感白粉病近等基因系材料在接种白粉菌后均诱导表达硫代硫酸硫转移酶基因TaTST,并在接种后0~48 h内呈现2次诱导峰值,分别与白粉菌初次接触识别和附着胞侵入、吸器形成时间相对应,也与2次氧突发时间对应。TaTST在感病材料上的诱导表达水平明显高于在抗病材料上,由此导致的活性氧过度清除可能是导致感病反应的原因之一。TaTST也参与抗病反应过程。利用病毒诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing, VIGS)创造了TaTST基因沉默的抗病植株。尽管充分发病时间后沉默植株叶片上并未观察到肉眼可见的病斑,但侵染早期白粉菌成功侵入频率的增加和次级菌丝的有限伸长说明TaTST沉默植株抗病水平下降。TaTST沉默导致乳突致密度下降和H₂O₂在细胞内的扩散时间延迟。因此,TaTST可能通过调节活性氧的积累和扩散、乳突的形成等小麦-白粉菌互作早期的寄主细胞反应而参与小麦对白粉菌的抗侵入过程。     

酿酒酵母蛋白激酶Tos3在氧化胁迫应答中的作用

旨在研究TOS3蛋白激酶在酿酒酵母细胞氧化胁迫应答信号通路中的作用。通过PCR扩增得到TOS3基因的蛋白质编码序列片段,将其克隆到pYES2/NTA上构建pYES2/NTA-TOS3质粒上,用构建好pYES2/NTA-TOS3质粒转化酵母菌细胞得到相应酵母菌株细胞,此细胞即为TOS3过量表达细胞。诱导此酵母细胞过量表达带His6标签TOS3蛋白激酶,免疫印迹方法鉴定过表达的蛋白激酶。最后,用H2O2处理TOS3过量表达细胞、TOS3缺失突变体细胞、野生型细胞、转入空载的野生型细胞。结果表明：4种细胞在未处理条件下生长状态无明显差异;在H2O2处理后,野生型细胞在125倍稀释生长点上比TOS3突变体细胞生长状态略好,而TOS3过量表达细胞与转入空载的野生型对照细胞和野生型细胞对比均显示出TOS3过量表达细胞的生长状态较好。野生型细胞对H2O2胁迫的耐受性比TOS3突变体细胞略强;过量表达TOS3蛋白的细胞对H2O2胁迫耐受性比野生型增加;说明TOS3在酵母细胞氧化胁迫应答过程中起正调控作用。     

Mechlppdk基因在木薯中的表达分析及RNA干扰载体构建和遗传转化

本研究为了明确丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)在木薯中的表达谱,创制Mechlppdk的干扰株系,以期为Mechlppdk的功能研究提供材料。本研究以栽培型木薯Arg7为材料,用qPCR的方法分析Mechlppdk在木薯根、茎、叶中的表达谱;采用RNA干扰的方法,构建Mechlppdk的干扰载体,并遗传转化木薯脆性愈伤,经木薯再生体系获得转基因苗,在添加抗生素的培养基上进行生根筛选,经PCR鉴定获得Mechlppdk的干扰株系。用qPCR的方法鉴定Mechlppdk在干扰株系的表达情况。结果表明,Mechlppdk在木薯叶片中表达量最高,达到管家基因的50%。在Mechlppdk的转运肽区,选取1个保守区段设计引物,构建RNA干扰表达载体pART27-Mechlppdki,将表达载体转化农杆菌LBA4404,侵染木薯脆性胚愈伤,获得阳性转基因木薯苗7个株系。通过qPCR分析发现各株系Mechlppdk转录本有不同程度的降低。通过以上分析表明本研究获得了干扰效率较高木薯Mechlppdk干扰株系,将为解析木薯Mechlppdk的功能提供研究材料。     

Introgression of antioxidant activity into cassava (Manihot esculenta C.): an effective technique for extending fresh storage roots shelf life

Physiological postharvest deterioration (PPD) of cassava is the main constraint affecting its nutritional and economical values. PPD is induced by wounds when detaching storage roots from mother plant during harvesting. It is accelerated by the reactive oxygen species (ROS) such as oxygen ion (O₂) and peroxide (O₂)^?2. The carotenoid content and its antioxidant property can help in extending shelf life of cassava storage roots. The primary mode of action of carotenoids as antioxidant is to quench singlet oxygen. Cassava breeding was reported to successfully introgress and improve carotenoid content into cassava. The two types of phytoene synthase (PSY) enzymes (PSY1 and PSY2) are key regulators of carotenoids accumulation in cassava. Carotenoids formation and accumulation in cassava storage roots are induced by a single nucleotide polymorphism in PSY2 which causes a non‐conservative amino acid exchange. This single nucleotide polymorphism in PSY gene is co‐segregated with β‐carotene in cassava storage roots, a phenomenon that could help to unravel the mechanism of introgression of carotenoids into cassava. This article investigates breeding feasibility for improving quality of cassava landraces in developing countries.     

一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C.将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1.将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度.Western blot 分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应.对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值.