马铃薯R2R3-MYB转录因子的克隆及植物表达载体的构建

MYB转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,广泛参与植物初生和次生代谢调控、细胞形态的建成、环境胁迫的应答等。前期转录组测序表明抗晚疫病的马铃薯材料加湘1号接种晚疫病菌后其MYB基因家族中的一个R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243的表达量显著上调。为了探讨R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243在马铃薯晚疫病抗病过程中发挥的作用。本研究通过PCR扩增了加湘1号中的该基因,并通过XcmⅠ酶切、连接将其装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-JX-R2R3,并转化到农杆菌GV3101中。该研究为R2R3-MYB转录因子的基因转化及后续的功能分析提供了理论指导。     

AP2/ERF转录因子对植物非生物胁迫的应答机制研究进展

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)家族转录因子是植物中的一大类转录因子,最早从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离出。该家族转录因子一般包含两个AP2/ERF结构域,该结构域大约由60～70个氨基酸组成与DNA结合有关。AP2/ERF家族参与非生物胁迫的反应,比如干旱胁迫、高盐胁迫和低温胁迫等。这些胁迫会激活植物激素ABA、茉莉酸(jasmonate, JA)、乙烯(ethylene, ET)、水杨酸(salicylic acid, SA)等信号途径,同时激活AP2/ERF转录因子家族基因的表达,进而调控其下游功能基因的表达。本研究综述了近年来有关植物AP2/ERF转录因子响应非生物胁迫应答机制的新进展,探讨了该家族转录因子的结构特点、分布,及其对植物发育和次级代谢的影响以及对非生物胁迫的应答。     

棉花ERF-B3亚组转录因子基因GhERF5-3的克隆及表达

植物在受到病原菌侵染时,ERF转录因子被诱导调控抗病相关基因的表达。为了研究棉花AP2/ERF-B3类转录因子在棉花抗病调控中的作用,用电子克隆及RT-PCR技术,从陆地棉抗枯萎品种‘中棉所12’根部c DNA克隆得到一个新的ERF转录因子Gh ERF5-3(登录号:MF197875)。利用q RT-PCR检测枯萎病及不同激素处理后该基因的表达。结果表明:其c DNA全长为672 bp,编码223个氨基酸,分子量24.95 k D,等电点为9.04,含有一个典型的保守AP2结构域,通过进化树分析属于B3亚组。枯萎病菌侵染后,随着侵染时间的延长,Gh ERF5-3基因呈现出先增后降的趋势,在24 h时间点,其相对表达量达到峰值;ET和Me JA处理后,Gh ERF5-3基因呈上调表达。SA处理后为下调表达。推断Gh ERF5-3基因响应枯萎病菌。     

银杏AP2/ERF转录因子鉴定及其ERF家族在逆境胁迫下的表达分析

AP2/ERF转录因子广泛参与银杏的生物学过程,其ERF基因家族存在着通过调控次生代谢来应对环境压力的可能。为探究ERF基因家族在这一过程中的应答机制,本研究分别构建了紫外和干旱处理下银杏叶转录组数据库,利用在线生物信息学工具对银杏AP2/ERF转录因子的保守结构域、理化性质及基因家族同源性进行分析,同时利用转录组测序技术检测了ERF基因家族在这两种逆境胁迫下的表达情况,筛选其中5个与类黄酮等代谢相关的ERF基因进行荧光定量PCR验证分析。结果表明,在银杏中共鉴定到61个AP2/ERF转录因子,根据其保守结构域特点分为4类,即ERF亚家族28个、DREB亚家族23个、AP2和RAV亚家族分别为5个。不同成员之间的氨基酸数目、等电点(pI)等理化性质有较大差别。从与拟南芥、大豆的序列同源性分析结果来看,同一个亚家族的成员之间亲缘关系较近。GbERF亚家族和GbDREB亚家族同属于银杏ERF基因家族,成员数最多。转录组预测分析结果显示,大部分ERF基因家族成员在紫外和干旱胁迫诱导下的基因表达量会增加。经验证,5个基因表达量的变化情况总体与预测结果一致。本实验结果为后期开展银杏ERF基因家族的功能研究提供科学依据。     

水稻AP2/ERF转录因子参与逆境胁迫应答的分子机制研究进展

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)是植物特有的转录因子家族,广泛参与生长发育和胁迫应答等多种生物学进程。水稻是我国重要的粮食作物,但在其生长过程中受到多种逆境的影响。目前研究发现AP2/ERF转录因子在水稻逆境应答中扮演十分重要的角色。本文结合国内外研究进展,综述了水稻AP2/ERF转录因子的分类和结构,并梳理了不同亚家族的AP2/ERF转录因子响应病害、干旱、高盐和低温胁迫的功能和机制研究进展,为深入阐释水稻AP2/ERF转录因子调控逆境应答的分子网络及品种改良提供参考。     

全基因组鉴定和表达模式分析玉米AP2转录因子

AP2属于AP2/ERF转录因子家族中的一个亚族,其主要特征是具有2个独立的AP2/ERF结构域。本研究利用生物信息学的方法在玉米基因组中鉴定到22个玉米AP2转录因子,并对其理化性质、基因结构、保守基序、系统进化关系和表达模式进行了分析。结果表明,玉米AP2家族成员的理化性质差异较大,且都属于亲水性蛋白。系统进化分析表明玉米AP2家族基因被分为euANT、baselANT、euAP2三个亚组,相同亚组的基因具有相似的基因结构和保守基序。共线性分析发现玉米AP2家族基因中不存在基因串联重复事件,只存在两对片段复制事件,同时结果表明禾本科AP2家族基因之间具有很好的共线性关系。表达模式分析发现ZmAP2基因广泛参与植物的生长发育。转录组数据分析发现,在盐胁迫下一共鉴定到16个ZmAP2基因。本研究为进一步研究玉米AP2转录因子家族的生物学功能提供了科学依据。     

水稻耐旱性基因OsERF65的克隆、表达及转录自激活活性分析

ERF家族转录因子普遍存在于植物中,在植物生长发育、抵抗逆境的过程中发挥着重要作用。本研究从‘珍汕97B’中克隆到一个耐旱相关基因OsERF65,属于ERF转录因子家族的成员。生物信息学分析表明,OsERF65含有一个保守的AP2结构域,与AtERF73等同源蛋白的亲缘关系较近。OsERF65的启动子区域含有多个响应非生物胁迫及激素处理的顺式作用元件,定量PCR结果显示该基因的表达明显受干旱、高盐等非生物胁迫处理的诱导;酵母中转录激活活性结果显示OsERF65具有一定的转录自激活活性;烟草瞬时表达结果表明Os ERF65蛋白定位于细胞核中。本研究为进一步研究OsERF65的生物学功能奠定了一定的基础。     

露地菊(Chrysanthemum×grandiflora)CgDREB基因克隆和生物信息学分析

DREB转录因子在植物抗逆过程中起关键性作用,它可以激活一系列抗逆功能基因的表达从而综合提高植物的抗逆性。为探究露地菊DREB基因的功能,本研究通过结合RNA-Seq和RT-PCR技术从露地菊‘纽9717’中克隆得到CgDREB基因,并对该基因及其蛋白进行生物信息学和表达模式分析。结果显示,CgDREB基因ORF全长450 bp,编码149个氨基酸,预测蛋白相对分子量16.742 kD,理论等电点9.32,为亲水性蛋白,没有跨膜结构,无信号肽。功能结构域分析表明其具有一个高度保守的AP2/ERF结构域。同源性分析其属于AP2/ERF转录因子家族DREB亚组A-5组。蛋白质二级结构中无规则卷曲占57.05%,α-螺旋占28.86%,延伸链占10.07%,β-转角占4.03%。三级结构显示其以单体蛋白结构存在。RT-qPCR分析表明,高盐、干旱、低温和ABA均能诱导CgDREB基因的表达。本研究为深入了解露地菊A-5组DREB转录因子及其抗逆调控机制提供基础,为露地菊品种改良提供理论依据。     

陆地棉幼苗NaCl胁迫下转录因子的转录组学分析

以棉花耐盐种质早熟长绒7号和感盐种质南丹巴地大花为材料,利用转录组测序(RNA-Seq)技术分析2个种质在200 mmol L–1 Na Cl胁迫4 h和24 h后幼苗叶片的转录因子家族及转录因子的表达情况。结果表明,从样本中鉴定出54个转录因子家族的2815个转录因子。盐胁迫4 h后,长绒7号有249个转录因子基因表达发生变化;南丹巴地大花中有261个转录因子基因表达发生变化。在胁迫24 h后,2个种质对盐响应的转录因子数量均剧增。只在耐盐种质长绒7号特异表达的有106个(4 h)和184个(24 h)转录因子基因,对于2个种质共同表达的转录因子有143个(4 h)和282个(24 h)。通过筛选,鉴定出26个与耐盐相关的转录因子家族124个转录因子基因,并采用荧光定量验证转录组数据的准确性。推测高表达的11个转录因子的基因CotAD_66280(HD-ZIP)、CotAD_47058(ERF)、CotAD_18472(G2-like)、CotAD_04289(C2H2)、CotAD_57763(HSF)、CotAD_23656(TCP)、CotAD_02221(ERF)、CotAD_23975(WRKY)、CotAD_54036(MYB)、CotAD_27788(NAC)和CotAD_23815(HSF)有可能与陆地棉抗盐性密切相关,可作为陆地棉耐盐育种的候选基因源。     

AP2基因家族的起源和棉花AP2转录因子在抗病中的作用

植物中庞大的AP2基因家族成员因其广泛参与植物响应外界环境胁迫、生长发育相关的转录调控而备受重视。AP2基因曾被认为植物所特有,但最近在蓝藻、线虫和病毒中发现了具有AP2结构域和位点特异核酸内切酶的蛋白。所以有人认为当今植物中的AP2基因起源于细菌或者病毒的基因的横向转移,AP2结构域可能来自后来进化为叶绿体的原始蓝细菌的内共生。ERF是AP2大家族中的一个亚族,它编码的蛋白能特异结合含有GCC盒的病程相关基因的表达,参与植物抗病反应。ERF基因的表达受到疾病相关刺激以及环境胁迫的诱导,并且在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用。同时,某些ERF基因在转基因植物中的超表达表现了一定的广谱抗性,因而在分子育种中具有一定的应用前景。棉花上AP2基因家族的基因克隆与分析最近才得以进行,介绍了我们在棉花上相关的研究工作并讨论了它们在植物抗病反应中的作用。     

花椰菜转录因子ERF056的克隆、分子特征及盐胁迫表达谱分析

AP2/ERF转录因子在植物中广泛存在,其在植物生长发育及逆境应答过程中均发挥重要作用。但目前对花椰菜中AP2/ERF转录因子及其功能知之甚少。本研究利用前期花椰菜转录组数据,采用RT-PCR等方法从花椰菜中分离并克隆得到一个AP2/ERF转录因子:ERF056。基因序列及分子特征分析结果表明,花椰菜ERF056全长741 bp,编码246个氨基酸,具有一个AP2/ERF结构域,其编码产物为疏水性蛋白,无跨膜结构,内部以无规则卷曲和α-螺旋为主。聚类分析结果显示,花椰菜ERF056与油菜和甘蓝中相应转录因子具有较高相似性。转录表达谱分析结果显示,ERF056在花椰菜不同组织中均有表达,其中花球中表达量最高。盐胁迫表达特征分析表明,花椰菜ERF056在盐胁迫条件下呈下调表达,暗示其负向响应盐胁迫。相关研究为深入揭示花椰菜ERF056在盐胁迫应答中的功能及调控机制提供了帮助。     

芍药分生组织决定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息学分析

花分生组织决定基因APETALA2(AP2)属于植物ABCDE模型基因,在花器官发育过程中起着重要的调控作用。为进一步了解芍药AP2基因的生物学功能,利用RACE扩增和测序技术克隆plAP2基因序列,利用生物信息学在线程序对其序列特征、蛋白结构及功能、亚细胞定位进行预测,并利用MEGA 5.0构建不同植物AP2分子进化树,最后利用qPCR检测其在内外花瓣中的差异表达情况。结果显示,克隆获得芍药AP2基因(plAP2)cDNA序列全长1 935 bp,其ORF全长为1 578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,plAP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,表明为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS);二级结构包括α-螺旋(24%)、β-折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);plAP2蛋白存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,plAP2蛋白包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethylene-Responsive factors,ERF)(151-213aa和243-306aa)。亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药AP2基因与牡丹高度同源且亲缘关系最近;qPCR检测显示外瓣AP2表达量均极显著高于内瓣(P0.01)。克隆出芍药AP2全长cDNA序列,系统地揭示了plAP2蛋白基本结构、功能位点区域、细胞定位以及组织表达情况,为今后深入研究plAP2基因功能提供基础素材和理论参考。     

合作猪HMOX1基因过表达载体构建及组织表达分析

为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。     

花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。