砂藓抗旱相关基因磷脂酶D的克隆和表达分析

磷脂酶D是广泛存在于植物中的一种磷脂酶,在细胞结构组成和生理功能的变化中具有非常重要的作用。在本研究中,以在砂藓(Racomitrium canescens)转录组数据库中获得的一条与抗旱相关的磷脂酶D基因为基础,采用RT-PCR技术克隆得到该基因的全长CDS序列,命名为Rc PLD。生物信息学分析结果表明,Rc PLD基因c DNA全长1 420 bp,含有894 bp的开放阅读框,能够编码长度为297个氨基酸的多肽链。Rc PLD蛋白质的生物信息学分析结果表明,Rc PLD相对分子质量为33.192 k D,理论等电点p I为6.60,不含有跨膜结构,存在信号肽,具有磷脂酶D的保守结构域,属于不稳定的疏水性蛋白质。实时荧光定量PCR分析表明,在砂藓的复水过程和脱水处理条件下Rc PLD基因均有差异表达,说明该基因可能参与砂藓中响应干旱胁迫的某些生理代谢途径。本研究可为苔藓植物中抗旱机制的研究提供理论基础。     

砂藓(Racomitrium canescens)抗旱相关过氧化氢酶基因RcCAT的克隆与表达分析

在植物抵御和适应干旱胁迫的过程中,细胞中的氧化还原水平的调节十分重要,过氧化氢酶(catalase,CAT)是细胞氧化还原调控系统中的一个关键酶。砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有强抗旱和旱后复水能力的藓类植物,其中能够响应干旱处理的基因和蛋白质可能与其抗旱特性功能相关。在本研究中,我们发现了一个在砂藓干旱处理转录组数据中呈上调表达的过氧化氢酶基因,将其命名为RcCAT,我们对这个基因的CDS序列进行了克隆和相关的生物信息学分析,并对砂藓复水和快速脱水过程中RcCAT具体的表达变化进行了检测。RcCAT的CDS全长1560 bp,编码含有519个氨基酸残基的多肽序列。对RcCAT蛋白质的氨基酸序列进行生物信息学预测,结果显示RcCAT相对分子质量为58.6 kD,理论等电点为6.52,不含有跨膜结构和信号肽,具有过氧化氢酶的保守结构域,与其它苔藓植物中的一些过氧化氢酶序列同源性较高,属于不稳定的亲水性蛋白质。在砂藓的复水和快速脱水过程中,RcCAT的表达水平均呈现快速大幅度的变化趋势,具有表达变化峰值,说明该基因具有能够快速响应干旱胁迫的可能性。本研究为从基因表达水平研究过氧化氢酶生物学功能提供理论依据,为进一步挖掘砂藓抗旱机制提供基础资源。     

甘蔗丙二烯氧化物合成酶ScAOS的克隆与表达分析

茉莉酸类物质(JAs)作为植物体内的内源生长调节物质,其包括了茉莉酸、茉莉酸甲酯、茉莉酸异亮氨酸及其相关衍生物质,对植物生长发育及抗性防御机制发挥着重要作用。丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase, AOS)是植物体内茉莉酸生物合成途径的关键酶,影响着茉莉酸类物质的生物合成,进而调节植物的形态建成和防御反应。本研究基于甘蔗转录组数据库,成功克隆到甘蔗丙二烯氧化物合成酶ScAOS的ORF全长序列,利用生物信息学方法了解该基因基本理化性质,并通过qRT-PCR实验分析不同组织和不同胁迫下ScAOS的表达水平差异。生物信息学结果表明,ScAOS基因开放阅读框为1 450 bp,编码482个氨基酸,等电点为6.30,不稳定系数为28.4,平均疏水性值为-0.12,预测ScAOS基因编码的蛋白为稳定酸性亲水蛋白。二级结构三级结构预测其元件结构主要为α-螺旋结构和无规则卷曲,该基因含有P450超家族的PLN02648的结构域,属于细胞色素P450基因家族中的CYP74A蛋白家族成员。系统进化树结果显示,ScAOS与高粱处在同一分支上,一致性高达90.4%。qRT-PCR结果显示,ScAOS在甘蔗根茎叶中均有表达,其中在茎中的表达量最高,在叶中的表达量最低。不同胁迫处理的表达差异结果显示,ScAOS均能响应盐害、干旱、植物激素、病虫害等环境胁迫。其中在NaCl、PEG、MeJA、病原菌和黏虫取食胁迫下表达水平均表现持续上升趋势,而在ABA处理下则表现下调趋势。本研究成功克隆到甘蔗ScAOS基因,并通过表达分析发现ScAOS在植物抗性防御方面作用显著。     

东亚砂藓bZIP转录因子RjbZIP基因的克隆及表达分析

为研究b ZIP转录因子在苔藓植物中的生物学功能,以东亚砂藓转录组测序获得的一个与b ZIP转录因子同源性较高的基因片段为基础,采用RT-PCR技术克隆得到该基因的c DNA全长序列,命名为Rjb ZIP。该基因c DNA全长为1 477 bp,包含1个1 422 bp的开放阅读框,编码473个氨基酸,预测蛋白分子量为5.114 k Da,等电点为6.97。Rjb ZIP蛋白属于不稳定蛋白,无跨膜区和信号肽结构,亚细胞定位于细胞核。该蛋白含有典型的b ZIP结构域,该结构域包含一个亮氨酸拉链区,一个碱性结构域和一个谷氨酰胺丰富区。实时荧光定量PCR分析显示,在快速脱水、缓慢脱水和脱水后复水处理过程中,东亚砂藓Rjb ZIP基因均能被诱导表达,且对脱水后复水的反应更为迅速,推测该基因参与东亚砂藓抵抗逆境胁迫的应答,为后续进一步研究其功能特征奠定了基础。     

砂藓RcPIP2基因的克隆及生物信息学分析

水通道蛋白是一类较小的跨膜蛋白质,在植物抵御非生物胁迫过程中具有非常重要的作用。为了研究砂藓水通道蛋白基因的生物学功能,利用干旱处理转录组测序获得的序列信息,克隆获得1个水通道蛋白家族中质膜内在蛋白基因序列,命名为RcPIP2。生物信息学结果显示,RcPIP2基因全长序列为1 267 bp,包含807 bp的开放阅读框,编码含有268个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质分子质量预测为28.3 ku,理论等电点为6.64,为疏水性较强的稳定性蛋白;无信号肽,为非分泌型蛋白;含有6个跨膜结构域。保守结构域分析发现,RcPIP2具有膜内在蛋白(MIP)家族信号序列、高等植物高度保守序列HINPAVTFG和2个天门冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)基序。二级结构包括α螺旋(37.31%)、β折叠(20.9%)、无规则卷曲(38.43%)。三级结构预测发现,RcPIP2蛋白质的立体结构为典型的四聚体形式,由4个圆筒状亚基和中间的孔道构成。系统进化树分析表明,RcPIP2与小立碗藓中的PIP2蛋白质亲缘关系较近,聚为一类。由此推测,RcPIP2基因为水通道蛋白家族成员。     

砂藓(Racomitrium canescens)RcRab基因的克隆及生物信息学分析

本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱处理转录组数据库中筛选获得小G结合蛋白基因Rab的mRNA序列,通过RT-PCR法扩增,得到RcRab基因的CDS序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该基因c DNA全长为1171 bp,包含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。预测该基因有Rab家族的保守结构域-G结构域。RcRab蛋白分子质量为23.29 kD,理论等电点为5.76,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。进化树分析表明,RcRab蛋白质与小立碗藓(Physcomitrella patens)Rab蛋白质亲缘关系最近。本研究可为进一步探索RcRab基因在苔藓植物中的抗旱机制提供数据基础。     

陆地棉体细胞胚发育过程中AOS基因家族的表达谱初步分析及功能预测

茉莉酸在调控棉花体细胞胚增殖方面有重要作用,而丙二烯氧化物合酶(AOS)是植物茉莉酸合成途径中的关键酶。作者鉴定出在胚发育过程中表达的AOS基因,这些基因编码区长度均在1500 bp左右,被定位在5条染色体上,有2个基因含有内含子。对其启动子元件分析发现,它们可能受激素和胁迫的调控在体细胞胚胎发生中起作用。荧光定量分析发现,这些基因在棉花不同组织中的表达模式主要分为3类,GhAOS1和GhAOS6在棉花胚发育过程中表达量相对较高,GhAOS2和GhAOS3在棉花愈伤和胚性愈伤中表达量相对较高,GhAOS4和GhAOS5在茎和叶中表达水平相对较高,暗示这些基因的表达有时空特异性,且GhAOS1和GhAOS6可能在棉花胚发育中发挥重要作用。亚细胞定位分析显示,大部分被定位在过氧化物酶体中,可能参与调控光呼吸、体细胞胚成熟和萌发。上述分析为进一步研究AOS基因家族在棉花体细胞胚发育中的功能奠定了基础。     

毛尖紫萼藓类泛素蛋白基因的克隆与表达分析

为研究类泛素蛋白基因在苔藓植物中的生物学功能,从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得了类泛素蛋白基因cDNA全长序列,命名为Gp-UBL5。该基因cDNA全长471 bp,包含1个222 bp的完整开放阅读框,编码73个氨基酸组成的蛋白。生物信息学分析表明,Gp-UBL5基因编码蛋白分子质量为8.525 kDa,等电点为7.84,为稳定型蛋白。进化分析显示,该编码蛋白与二穗短柄草、大麦等类泛素蛋白具有较高一致性,达96%~99%。实时荧光定量PCR结果表明,Gp-UBL5基因在复水和快速干旱的各个时期均有表达,推测该基因可能在毛尖紫萼藓的抗旱机制中发挥作用。     

‘西伯利亚’百合丙二烯氧化合酶LsAOS基因的克隆及其表达分析

丙二烯氧化合酶(allene oxide synthase,AOS)基因是茉莉酸(JA)合成途径中第一个特异性酶,具有调控植物体内JA合成积累的重要作用。本研究通过RACE技术克隆得到了‘西伯利亚’百合Lilium‘Siberia’中的AOS基因,并将其命名为LsAOS。该基因全长1 542 bp,编码513个氨基酸,其蛋白序列与小果野芭蕉的同源性最高,属于不稳定亲水蛋白。通过对‘西伯利亚’百合4个不同花期,9个不同组织器官进行实时荧光定量PCR(q-PCR)后发现,LsAOS在花蕾期中的表达量最高,随着花朵的逐渐开放表达量逐渐下降;LsAOS在叶片中表达水平最高,其次是内瓣、根、茎等。JA参与植物生长发育的全过程,与植物抗逆性和次生代谢反应有着密不可分的联系。AOS基因是JA途径中的关键基因之一,对JA的合成有着重要的调控作用。     

玉米油菜素甾醇生物合成关键酶基因ZmCYP90B1的克隆及其对逆境胁迫的响应

油菜素甾醇作为一类重要植物激素, 在植物生长发育和抵御逆境胁迫等过程中发挥重要作用。CYP90B1基因编码酶是其合成途径中关键限速酶。本研究针对迄今有关玉米CYP90B1基因应答逆境胁迫特征尚未见报道现状, 采用RT-PCR结合RACE技术, 从玉米中克隆了油菜素甾醇生物合成关键基因ZmCYP90B1 (GenBank登录号KY242373)。ZmCYP90B1全长2058 bp, 开放阅读框为1518 bp, 编码506个氨基酸。ZmCYP90B1蛋白预测分子量为57.66 kD, 等电点为9.54, 含有1个跨膜结构域及1个p450保守结构域。序列比对表明, ZmCYP90B1与其他物种CYP90B1蛋白高度相似, 但在单双子叶植物中进化上具有明显差异。实时荧光定量PCR结果表明, 非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)、虫害(甜菜夜蛾取食)和茉莉酸甲酯均诱导ZmCYP90B1表达, 表明该基因响应多种非生物胁迫, 参与植物对虫害和茉莉酸甲酯的响应。进一步构建过量表达ZmCYP90B1基因的烟草株系并检测表明该烟草株系抗旱性增强, 叶片失水率下降, SPAD值增大。此外, 干旱胁迫下转基因烟草超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性以及游离脯氨酸(Pro)的积累量均显著高于野生型, 丙二醛(MDA)和脱落酸(ABA)含量明显低于野生型。通过检测下游胁迫响应基因表达, 表明ZmCYP90B1提高植物抗旱性可能不依赖ABA途径, 而与其对抗氧化相关途径相关基因的转录调控有关。     

红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥

WRKY转录因子在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。本研究根据红麻转录组unigene序列(CL3883.Contig4),设计引物进行PCR扩增,经sanger测序获得全长为957 bp的HcWRKY71基因cDNA序列。该基因开放读码框为957 bp,编码1个含有318个氨基酸的蛋白,具有1个WRKY功能保守结构域,属于II类WRKY转录因子。在盐胁迫下,HcWRKY71基因表达量随NaCl溶液浓度升高而增加;在干旱胁迫下,HcWRKY71基因表达量随干旱胁迫时间的增加呈现先下降再上升然后再下降的趋势;在重金属镉胁迫下,HcWRKY71基因表达量随CdCl2溶液浓度的增加而降低。表明该基因表达受盐、干旱和重金属镉胁迫的诱导。利用农杆菌介导花序浸染法将该基因转化拟南芥发现,HcWRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性,这为进一步研究HcWRKY71基因的耐逆机制奠定了坚实的基础。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。     

花生膜联蛋白基因AhAnn1的克隆与表达分析

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽,预测分子量为36.10 k Da,等电点为7.07。预测该基因编码的蛋白含有膜联蛋白Annexin保守结构域,定位于细胞质中。蛋白序列多重比对和系统发育分析表明,花生与大豆、苜蓿、鹰嘴豆等豆科植物中的膜联蛋白相似性最高,亲缘关系最近。荧光实时定量PCR结果显示,AhAnn1在根系和叶片中的表达量随干旱胁迫程度的增加而增加。由此推测AhAnn1是一种干旱胁迫应答基因,在花生逆境调控中发挥作用。结果为进一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境胁迫相关分子机理提供了理论基础。     

甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 广泛存在于真核生物细胞中, 参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列, 并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因cDNA全长序列, 命名为ScSEC14 (GenBank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示, ScSEC14基因全长1617 bp, 包含一个1008 bp的完整开放阅读框, 编码335个氨基酸; ScSEC14为不稳定的亲水性蛋白, 不存在信号肽; 蛋白二级结构元件多为α-螺旋, 具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外, 系统进化树分析揭示, 该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明, ScSEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现, ScSEC14基因在甘蔗中组成型表达, 在蔗皮中的表达量最低, 蔗叶中的表达量最高, 约为蔗皮的4.9倍; 该基因在PEG、NaCl、CaCl₂和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此, 甘蔗ScSEC14基因可能参与Ca ²⁺和SA介导的抗逆信号通路, 积极响应逆境胁迫, 尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。     

红麻海藻糖生物合成关键酶基因HcTPPJ的克隆及响应逆境的表达分析

Trehalose biosynthesis key enzyme gene TPP plays an important role in plant response to various abiotic stresses. In this study, in order to clarify the role of TPP gene in response to abiotic stress in kenaf, a specific primer was designed according to the sequence of CL541.contig2unigene, and the full-length cDNA sequence of TPP gene was obtained by PCR. Bioinformatics analysis showed that TPP had an open reading frame (ORF) length of 1128 bp, and encoded a protein containing 375 amino acids. The results of amino acid sequence consistency indicated that the agreement between the amino acid sequence of protein and that of TPPJ from other species was 71.18%, so the gene named as HcTPPJ. HcTPPJ was expressed in roots, stems and leaves. Under salt or drought stress, HcTPPJ was up-regulated significantly with the extension of stress treatment, indicating that the gene was involved in the response process of salt or drought stress in kenaf. Under the same conditions, HcNCED3 and HcAOC was significantly up-regulated, while the change of HcTPPJ expression was not obvious under ABA stress; HcTPPJ was significantly down-regulated, under the stress of MeJA for six hours. Therefore it was speculated that the HcTPPJ gene expression may be not regulated by the signal molecule of ABA, but negatively regulated by methyl jasmonate signal molecule. This study will lay a solid foundation for further elucidating the role of the gene in response to salt and drought stress in kenaf.