栽培大豆和野生大豆的Glyma13g21630基因多样性分析

利用Sanger方法对49份野生大豆,46份地方品种和38份选育品种的Glyma13g21630基因测序,采用DNAStar、Mega、DNAsp和Tassel软件分析Glyma13g21630的单核苷酸多态性(SNP)位点在不同类型大豆群体的分布规律。结果表明,在133份供试种质中检测到多态性位点29个,包括22个SNP和7个InDel,多态性频率分别为1SNP/138 bp和1InDel/434 bp。Glyma13g21630基因序列中多态性位点的分布不均匀,其中内含子3和5为变异富集区,其他区域变异较小。单倍型分析表明,Glyma13g21630在野生大豆和栽培大豆中的多态性位点数目逐渐减少,分布范围也越来越窄;连锁不平衡分析表明,野生大豆的7个高频SNP位点中有42.86%处于极显著的连锁不平衡状态;Ka/Ks>1,说明野生大豆在向栽培大豆的进化中,某些位点受到正向选择,多态性显著降低。Glyma13g21630基因在大豆由野生向栽培驯化的过程中因正向选择作用而固定了有益变异,表现出瓶颈效应。     

小麦TaPK7基因单核苷酸多态性与抗旱性的关系

以抗旱性不同的45份六倍体小麦和5份小麦的二倍体近缘种为材料, 通过测序检测TaPK7基因的单核苷酸多态性, 研究了TaPK7基因多态性与抗旱性的关系, 旨在为发掘利用小麦抗旱基因资源奠定基础。50份材料TaPK7序列总长220 448 bp, 其中有64个SNP和9个InDel, 二者的频率分别为1 SNP/3 445 bp和1 InDel/24 494 bp。编码区的核苷酸多样性π值小于非编码区, 可能是由于编码区承受的选择压力较大。同义突变(Ka)与非同义突变(Ks)比值是0.415, 表明该基因受负向选择影响, 属于相对保守基因。在编码区检测到16个单核苷酸突变, 多存在于抗旱材料中。共检测到21种单倍型, 其中5种为强抗旱材料单倍型, 2种为干旱极敏感材料单倍型, 11种中等抗旱材料单倍型, 另外3种单倍型中同时包括抗旱材料和干旱敏感材料, 初步揭示了TaPK7基因的单核苷酸多态性与抗旱性相关。     

水稻抽穗期控制候选基因的SNP/InDel多态性分析

抽穗期是水稻的一种重要农艺性状，但其遗传控制机理还不清楚。本文利用数据库搜索的方法，搜索并分析了30个与拟南芥光周期调控途径花期控制基因同源的水稻基因。利用水稻多态性数据库，得到了发生在这些基因以及Hd6、Ehd1、OsSOCl上的820个SNP及191个InDel位点。分析表明，这些位点不是平均分布到每个基因上。SNP／InDel含量较高的基因存在SNP／InDel的热点片段。14．1％的SNP位点，及7％的InDel位点分布在基因的编码区。本文也分析了侯选基因侧翼5Kb范围内的SNP／InDel多态性位点。按照侧翼多态性位点数目的分布可以将侯选基因分成4种类型，即两侧保守型、两侧热点型、单侧热点型、一侧热点一侧保守型。     

水稻NOL(NYC1-like)基因序列多样性、单倍型效应以及表达谱分析

NOL(NYC1-like)基因编码的蛋白在体外试验中显示出Chlb还原酶活性,但是该基因序列变异是如何影响水稻持绿表型的目前还没有报道。本研究利用本实验室的533份已测序的核心种质材料,对该基因的序列进行了多样性分析,本研究将出现频率5%的SNP用于数据分析。该基因含有7种单倍型,Hap1和Hap4中SNP位点大致相同,Hap2、Hap3、Hap6含有相似的SNP位点。在单倍型效应分析中,考虑了核心种质的群体结构影响因素,将每个亚群的单倍型叶绿素含量进行了t-test。结果发现Ind亚群中hap4与hap3的差异极显著,hap3与hap4不仅在第一个外显子(181 bp)处产生非同义突变,而且还含有大量的启动子区的变异位点,这些位点有待于后期的功能验证。通过本实验室的表达谱数据库显示,在用植物激素处理的3份水稻材料幼苗中的NOL基因表达量非常高,这说明NOL基因与植物激素的调控有关,其次发现在衰老的叶片中表达量比较高,说明在叶片衰老后期NOL基因参与叶绿素的降解。研究结果从RNA水平为NOL基因调控叶绿素降解作用机理奠定了理论基础。     

基于全基因组关联分析挖掘野生大豆蛋白含量QTL

为了充分挖掘野生大豆种质资源中的高蛋白基因及其连锁标记,以来自中国、韩国和日本,涵盖第4,5,6,7,8熟期组的508份野生大豆种质资源为材料,通过全基因组关联分析挖掘与野生大豆中高蛋白基因相关的SNP.参试材料蛋白含量数据从美国农业部种质资源信息网下载,为2a利用凯氏定氮法测定蛋白含量数据平均值,基因型数据从Soybase网站下载,利用Illumina公司大豆50K芯片(SoySNP50K BeadChip含有52041个SNP标记)检测获得.结果表明,参试材料蛋白含量呈正态分布,介于38.1％ ～56.9％,平均48.1％,标准差2.71％.遗传结构分析将参试材料划分为3组,分别包含271,111,126份材料.基于混合线性模型的关联分析,共检测到与蛋白含量相关的SNP位点74个,散布在19条染色体的60个单倍型区段内.显著性SNP位点LOD平均值为3.47,SNP位点BARC_1.01_Gm_01_54656209_A_G的LOD值最大,为5.18.根据显著性SNP位点富集程度,确定第11号染色体常染色质区15128832～15253199 bp、第12号染色体异染色质区26842687～27818244 bp的单倍型区段为本研究中的2个蛋白含量显著性相关区段,命名为HAP_11_1和HAP_12_1.HAP_11_1中,SNP位点BARC_1.01_Gm_11_15167305_G_A的LOD值最大,为3.80,可解释遗传变异为2.88％.HAP_12_1中,SNP位点BARC_1.01_Gm_12_27563620_C_T的LOD值最大,为4.12,可解释遗传变异为3.23％.为野生大豆高蛋白基因育种利用提供了检测标记,为野生大豆高蛋白基因克隆提供了线索.     

甜玉米胚乳突变基因shrunken2的序列变异解析

Shrunken2基因编码葡萄糖焦磷酸化酶的大亚基,是玉米淀粉合成途径中的限速酶,shrunken2是Shrunken2的隐性突变等位基因,对甜玉米品质和风味的形成起着重要的作用。本研究以玉米B73的Shrunken2基因为参考序列,在58份甜玉米自交系中进行shrunken2基因的重测序,共获得了7 635 bp的核苷酸序列,涵盖了20个外显子,17个内含子以及3'UTR区域。基因多态性分析发现,在供试群体中共有多态性位点105个,包括78个SNP和27个Indel。与普通玉米B73的Shrunken2序列之间存在58个多态性位点差异,包括50个SNP和8个Indel,其中位于编码区的SNP位点包含2个同义突变和7个非同义突变。根据shrunken2基因全长序列和编码区序列可将该群体分成14种和4种单倍型。中性检测表明该基因经历了自然和人工双重选择过程。     

Amy6-4基因遗传多样性及其与α-淀粉酶活性的关联分析

α-淀粉酶活性是影响大麦种子发芽和麦芽制作及啤酒酿造的重要性状,Amy6-4为编码高等电点的α-淀粉酶基因,挖掘其高活性的等位变异对啤酒大麦的品种改良具有指导意义。通过对58份大麦品种中Amy6-4基因的重测序,研究了该基因的核苷酸序列以及在品种间的遗传多样性,并在群体结构分析的基础上,进行了核苷酸多态性与α-淀粉酶活性的关联分析。结果表明,Amy6-4基因共存在7个单核苷酸变异位点(SNP),构成5种单倍型。其中,H_3单倍型最普遍,发生频率为51.7%(30/58);其次为H_1单倍型,发生频率为39.7%(23/58);其他3种单倍型发生的频率约为10%。SNP位点及其构成的单倍型均与酶活性无关联性。     

华中樱桃叶绿体InDel标记鉴定及应用

为筛选可用于华中樱桃遗传多样性分析和基因分型的叶绿体InDel标记,本研究以湖南省5个地理位置的华中樱桃群体为材料,鉴定了候选叶绿体非编码区序列中的InDel位点并应用于群体遗传多样性分析。结果表明,9个叶绿体非编码区片段中共有20个InDel位点,其中单碱基InDel位点9个,多碱基InDel位点11个,InDel出现频率约0.74%。非编码区trnR-UCU-atpA的InDel位点最多(5个),其次是trnHGUG-psbA (3个)和psbC-trnS-UGA (3个)。50个华中樱桃个体的核苷酸多态性(Pi)为0.001 51,可分为13个单倍型。群体ZF的核苷酸多样性最为丰富(Pi=0.001 58),其次是群体XP (Pi=0.001 40)、PJ (Pi=0.001 36)和LY (Pi=0.000 54)。从分布情况来看,单倍型H3为群体LY和PJ所共有,H5为群体ZF和XP共有,H6为群体PJ、XP和ZF共有,H8为群体PJ和XP共有;其他单倍型特异性地分布于各群体。系统进化分析结果显示,13个单倍型可分为两支：单倍型H5、H7和H11聚为一支,另外10个单倍型聚为...     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。     

基于转录组数据的三雌蕊小麦中SNP/InDel位点的挖掘

为了进一步定位Pis1基因,加快小麦的分子标记辅助育种工作,获得高质、高产、稳产的小麦品种。以川麦28(CM28)与其三雌蕊近等基因系CM28TP为研究材料,对CM28和CM28TP幼穗的3个阶段(幼穗长度为0.2～0.5 cm, 0.5～0.7 cm, 0.7～1.0 cm)进行转录组测序,然后通过GO数据库对变异位点所在的基因进行分类分析,并选取4个位于Pis1基因附近的SNP标记进行验证。结果表明,CM28TP和CM28幼穗3个阶段共有的SNP/InDel位点为5 310个,其中SNP位点5 024个,InDel位点286个。SNP位点中转换类型(63.33%)多于颠换类型(31.28%),两者的比值达到了2.02;InDel位点中插入类型(152个)多于缺失类型(134个);SNP/InDel位点在A基因组上分布最多、其次是B基因组、D基因组上最少。对SNP/InDel所在的基因进行GO分类注释表明,生物学进程中基因的占比最高,其次是细胞组分和分子功能。SNP/InDel位点对蛋白质功能的影响预测表明,有36个变异位点会严重影响蛋白质功能,中度影响蛋白质功能的位点有1 279个。从Pis1基因的定位区间附近筛选了4个SNP位点进行PCR扩增和测序验证,发现这4个位点与RNA-Seq分析结果一致,这表明挖掘出的SNP/InDel位点是准确的。本研究丰富了小麦中的SNP/InDel标记,为小麦高密度遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助选择育种奠定了基础,同时开发出的4个位于Pis1基因附近的SNP标记,为图位克隆该基因提供了可能。     

DNA sequence polymorphisms and their application to bread wheat quality

Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) constitute an abundant source of DNA polymorphisms, which have been successfully used to identify loci that are associated with a particular phenotype. Additionally, such markers could be efficiently used in combination with doubled haploid technology to improve the efficiency of breeding programmes. Information on such markers in plants is still scarce. For bread wheat, SNP data are restricted to a few genes. This can be explained by the hexaploidy of Triticum aestivum which makes SNP discovery difficult. We developed a novel method for SNP discovery in bread wheat. The strategy is based on the development of highly specific PCR-primers, which were used to sequence 27 lines. SNPs were discovered from sequence alignment data. Some SNPs were identified by mass spectrometry in a collection of 113 lines, which were both evaluated for agronomic traits and genotyped at 42 neutral microsatellite loci. Traits investigated include: protein content, the quantity of high-molecular-weight glutenins and that of the GluBx subunit. The 42 markers were used to infer population structure, which was included in linear models for association studies. The results of this preliminary study showed 89 SNPs in approximately 20 kbp, i.e., one SNP every 223 bp on average. Six SNPs were genotyped: three were located along the sequence of Glu-B1-1, while three non-synonymous SNPs were located along the sequence of the B homoeologous gene coding for SPA (Storage Protein Activator). The SNPs from Glu-B1-1 had a significant effect on the studied variables, whereas those of SPA had no effect. Such results might indicate that some haplotypes for Glu-B1-1 are linked to higher protein content, through an increased amount of high-molecular-weight glutenins, especially the GluBx subunit.     

水稻编码SAND结构域基因的序列与功能初步分析

为研究水稻SAND结构域蛋白的序列和功能,利用Blast在水稻基因组中搜索编码SAND结构域的基因,然后构建增强表达载体并通过遗传转化研究基因功能。结果表明,水稻基因LOC_Os01g57240(命名为OsULT1)编码的氨基酸序列含有SAND结构域和ULTB-box共有序列,与其他植物ULT氨基酸序列相似性为49.3%~92.3%,具有较好的保守性;35S::OsULT1转基因株系部分颖花发育异常,出现内稃发育滞缓或退化、浆片过度发育或数目变多、雄蕊数目3~7枚、雌蕊2枚的现象;颖花内产生多余的小花,表明OsULT1对水稻花分生组织正常分化具有重要的调控作用。     

牦牛血红蛋白β链基因多态性分析

研究采用PCR-SSCP技术对110 头牦牛血红蛋白β基因第2 外显子序列进行多态性分析,并对不同的等位基因进行测序,开展等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点分析。结果表明,110 头牦牛血红蛋白β基因第2 外显子共发现2 个等位基因,其中A为优势等位基因,A等位基因与B等位基因仅在外显子2 第58 位点存在A-T的变异,导致了丝氨酸（Ser）到苏氨酸（Thr）的变异,可能影响血红蛋白与氧的亲合力,是牦牛运氧能力较黄牛佳的原因。与黄牛血红蛋白β基因序列对比发现,牦牛的血红蛋白β链基因序列与黄牛血红蛋β链基因序列的同源性较高,高达98.94%。     

平欧杂种榛遗传多样性分析的SSR分析

本研究主要对杨树RAPD体系进行优化,以银白杨为试材,利用L16（45）正交试验设计和2个单因素试验,研究各主要参数的适宜浓度。结果表明,杨树RAPD优化后的反应体系：20μL反应体系中,含Mg2＋1.5 mmol/L、Taq酶2.0 U、引物0.2μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、模板DNA 50 ng。扩增程序为：94℃预变性3 min、94℃变性40 s、38℃退火60 s、72℃延伸90 s,共38个循环;最后在72℃延伸7 min后4℃保温。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物,证明该体系稳定可靠,可以用于杨树的遗传学分析。     

适于陆地棉品种身份鉴定的SNP核心位点筛选与评价

利用全基因组SNP信息, 筛选陆地棉品种特异的核心SNP位点组合, 可为陆地棉品种身份鉴定提供准确高效的检测手段。本研究利用棉花CottonSNP80K芯片对326份不同来源的陆地棉种质进行SNP分型。以南京农业大学陆地棉TM-1基因组Gossypium hirsutum (AD1) genome NBI v1.1版本为参考序列, 对SNP位点进行注释。结果表明, 93.85% (72 990/77 774)的位点检出率超过99%, 61 595 (79.20%)个SNP位点具有多态性, 其中76.32% (47 009)的位点最小等位基因频率(MAF)大于0.1。基于位点检出率大于0.99、位点具多态性、MAF大于0.2、杂合率小于0.05、每条染色体的SNP密度为400 kb/SNP左右等要求, 最终获得4857个覆盖全基因组的高质量核心SNP位点组合。这些核心SNP位点组合平均检出率接近100%; 平均MAF值为0.34; 平均杂合率为0.02; 99%以上的陆地棉材料均能够被准确鉴定。统计分析表明利用核心SNP位点组合与CottonSNP80K的鉴定结果呈极显著相关。本研究提供了包含4857个SNP位点, 适于陆地棉品种指纹图谱绘制的核心SNP位点组合, 可实现陆地棉品种身份鉴定和品种确权。     

Allele mining and haplotype discovery in barley candidate genes for drought tolerance

In the present study, allele mining was conducted on a panel of drought related candidate genes in a set of 96 barley genotypes using EcoTILLING, which is a variant of the targeting induced local lesions in genomes (TILLING) technology. Analyzing approximately 1.5 million basepairs in barley a total number of 94 verified unique haplotypes were identified in 18 amplicons designed for 9 genes. Overall, 185 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and 46 insertions/deletions (INDELs) were detected with a mean of 1SNP/92 bp and 1INDEL/372 bp genomic sequence. Based on overlapping haplotype sequences, markers were developed for four candidate genes (HvARH1, HvSRG6, HvDRF1, HVA1), which allows distinguishing between the main haplotypes showing either differences in amino acid sequence or which have larger INDELs in the promoter region. As “proof of concept”, the HvARH1 and HvSRG6 haplotypes were tested for the level of abscisic acid-induced gene expression in subsets of genotypes belonging to different haplotype categories. An integrated database was developed to contain information about the genes, genotypes, and haplotypes analyzed in this study. The database supplies profound information about the natural variation in the tested drought related candidate genes providing a significant asset for further mapping studies dealing with this highly polygenic trait.     

甘蓝枯萎病抗性基因FOC1序列分析及抗性相关变异位点分析

旨在发掘甘蓝抗枯萎病基因FOC1中与抗性相关的特异性单核苷酸多态性(SNP),为进一步开发FOC1特异分子标记提供理论依据。在对11份甘蓝自交系材料枯萎病抗病表型鉴定基础上,通过基因测序,对每份材料中FOC1等位基因及相应的氨基酸序列变异进行分析。结果表明,FOC1等位基因序列之间共存在92处SNP变异和2处Indel变异,其中包含C381A/G等18个在抗、感材料中表现出特异性差异的SNPs。此18个特异的SNP中转换型比率为86.11%、颠换型比率为13.89%,4种碱基变异率以T/C、G/A最高,分别占47.22%和38.89%,而C/G和A/C变异率共占13.89%。本研究也发现抗、感材料中存在4个特异的SNP,可造成3个氨基酸的变化。     

外源NO供体对水分亏缺下玉米叶片碳同化关键酶及抗氧化系统的影响

为了探讨外源NO供体(硝普钠, SNP)对水分亏缺下玉米叶片碳同化关键酶及抗氧化系统的影响及其调控机制, 在20% PEG-6000模拟水分亏缺胁迫下, 研究了SNP对玉米品种驻玉309幼苗叶片光合碳同化核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)和Rubisco活化酶(RCA)活性及其基因表达、抗氧化酶活性及其同工酶谱变化的影响。结果表明, 在水分亏缺胁迫下, SNP显著上调玉米叶片rbc L、rbc S、rca β基因的相对表达量, 尤其是叶片rbc S基因的相对表达量增加1.86倍, 叶片Rubisco、RCA活性分别提高32.7%和14.67%; 叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及其同工酶谱带的宽度和亮度显著增强, 而ROS积累量明显降低。说明在PEG水分亏缺胁迫下, SNP能显著提升玉米幼苗叶片光合碳同化能力及抗氧化酶活性, 降低ROS积累及其对细胞膜造成的损伤, 提高玉米的抗干旱性。     

五个绵羊群体KAP11-1基因核苷酸序列变异分析

为了分析绵羊KAP11-1基因的核苷酸序列变异,采用PCR-SSCP方法和DNA测序技术检测了欧拉羊、甘肃高山细毛羊、滩羊、湖羊和青海细毛羊5个群体(749只个体)KAP11-1基因的单核苷酸多态性,同时分析了等位基因频率、遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量等群体遗传特征。结果表明,5个绵羊群体的KAP11-1基因中共检测到c.93C/T、c.240G/A、c.285C/G/A和c.331A/G 4个单核苷酸多态位点,且c.331A/G为非同义突变。等位基因A在5个群体中出现的频率最高(87.70%),为优势等位基因,其次为等位基因B(基因频率为11.03%),等位基因C和D的频率最低(分别为0.53%和0.74%)。群体遗传学分析结果表明,滩羊KAP11-1基因的遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量均高于其余4个群体。KAP11-1基因作为羊毛经济性状的主要候选基因之一,其核苷酸序列的变异导致KAP11-1中相应氨基酸的改变,最终可能会影响羊毛纤维的结构和羊毛主要经济性状。     

乌头花叶病病原物的分子鉴定

研究旨在通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从分子方面鉴定附子地道产区四川江油乌头花叶病植株的病原物种类及分析其特性。通过对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的外壳蛋白基因(Coat Protein,CP)设计特异引物,对江油中坝附子GAP生产基地的乌头花叶病植株进行克隆、转化并测序。结果表明：从江油花叶病乌头植株中克隆得到基因大小为375 bp的片段,鉴定为黄瓜花叶病毒,命名为CMV-FZ,该序列为一段有效的长为375 nt的氨基酸编码区,推测编码125个氨基酸残基。依据外壳蛋白核苷酸序列建立了CMV不同分离物的系统进化树并对该序列进行蛋白组学分析,CMV-FZ与国内外已报道代表性CMV亚组分离物CP基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性为74.8%~98.2%和73.4%~99.2%,其中与与CMV亚组II的核苷酸和氨基酸序列相似性为96.1%-98.2%和96.0%-99.2%,该分离物与中国分离物（CMV-PCT2）氨基酸序列相似性最高,达到99.2%。遗传进化分析显示,CMV-FZ与中国分离物（Zin和Hubei-1）和美国分离物（DKRD）亲缘关系较近,聚在同一分支,属于CMV亚组II。以上结果表明伴有花叶症状的乌头受到黄瓜花叶病毒的侵染。