牛兔异种体细胞以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆研究

随着同种动物克隆后代的不断降生,人们又开始尝试异种动物体细胞核移植。用兔的卵母细胞作为核受体进行牛的体细胞核移植,研究表明,颗粒细胞作为供核体与兔去核卵母细胞的融合率(60.5%,57.9%)稍高于皮肤成纤维细胞的融合率(52.2%,48.4%),但两者间差异并不显著。颗粒细胞与皮肤成纤维细胞均采用饥饿培养和接触抑制培养两种不同的方式进行诱导处理,融合卵在电激活后能够卵裂并发育的情况差异显著(72.6%对51.4%;70.4%对52.2%)。有少数重构胚发育至囊胚,证明在哺乳动物异种重构胚早期发育中,异种细胞核与细胞质间是相容的。     

波尔山羊胚胎克隆的研究

以波尔山羊早期胚胎卵裂球作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同发育阶段胚胎的卵裂球对核移植重构胚的融合率的影响,研究Vero细胞对重构胚体外发育的影响,检测重构胚发育成为个体的能力。结果表明:以体内成熟和体外成熟卵母细胞做核移植受体,重组卵的融合率分别为85.7%和88.7%,二者之间差异不显著(P>0.05);以来源于8,16,32细胞阶段的卵裂球做核供体,重组卵的融合率分别为91.6%,86%,89.2%,三者之间差异不显著(P>0.05);融合后的重构胚与Vero细胞单层共培养,卵裂率65.5%和桑椹胚率32.7%均高于单纯TCM199培养的53.1%和10.6%(P<0.05);移植18枚融合后的重构胚于2只受体山羊输卵管,结果未获得妊娠;移植经体内培养得到的3枚桑椹胚于受体山羊子宫内,获得妊娠1只,总体的妊娠率为33%(1/3),怀孕的受体羊维持妊娠到期,产下1只母羔,初生重3.45 kg,一周岁时体重达到42.5 kg。通过自然交配产下一对波尔山羊羔。     

牛体细胞核移植方法研究

研究了牛体细胞核移植过程的去核方法、融合条件等对重构胚发育的影响,旨在探索一种简化的核移植操作程序.结果表明,添加FSH,LH,最高成熟率为81.7%.在电压为2.6 kV/cm时,融合率为93.96%.激活后重构胚在压制的WOW内进行培养,采用半卵法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别为61.2%和3.27%,盲切法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别是 70.8%和7.56%.     

受体卵母细胞来源和供体细胞类型对山羊体细胞核移植融合率的影响

以波尔山羊体细胞作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同供体细胞类型对核移植重构胚融合率的影响。结果:以体内成熟和FSH处理卵巢、屠宰场卵巢来源的体外成熟卵母细胞做核移植受体卵母细胞,重组卵的融合率分别为71.9%,78.4%,73.1%,三者之间差异不显著;以卵丘细胞和皮肤成纤维细胞做核供体,重组卵的融合率分别为77.1%,68.3%,二者之间差异显著。     

小鼠卵母细胞去核时间对卵丘细胞核移植的影响

对超数排卵的小鼠分别在注射HCG后14~16, 16~18, 18~20和20~22 h采小鼠卵母细胞用于 核移植, 观察小鼠卵母细胞的去核时间在体细胞核移植中的作用。结果显示, 在注射hCG后14~16, 16~18, 18~20和20~22 h, 小鼠卵母细胞去核效率分别为80.09 %(338/422), 73.12 %(283/387), 55.02 %(230/418)和48.74 %(193/396); 重构胚激活率分别为 66.20 %(190/287), 75.43 %(175/232), 84.78 %(156/184)和85.14 %(126/ 148); 重构胚的囊胚发育率分别为13.94 %(40/287), 7.33 %(17/232), 3.80 %(7/184)和1.35 %(2/148)。试验证实小鼠卵母细胞在注射hCG后14~16 h进行去核较为适宜。     

山羊卵母细胞的体外成熟研究

1.比较了在卵母细胞成熟液中添加相同浓度(10ng/ml)的表皮生长因子(EGF),胰岛素样生长因子(IGF),EGF IGF后,不同生长因子对卵母细胞体外发育率的影响。结果表明,在成熟培养液中添加EGF后,其卵母细胞的成熟率(70.9%)与对照组(67.3%)相比有所提高,但差异不显著;在成熟培养液中分别添加IGF、EGF IGF,其卵母细胞的成熟率分别为80.0%,82.4%,显著高于对照组卵母细胞的成熟率(67.3%)。2.比较了不同季节采集的卵母细胞在体外成熟的情况。结果发现,12月份到来年的1月份,采集的卵母细胞,其体外成熟率最高,为81.0%;11月份采集的卵母细胞,其体外成熟率次之,为74.1%;3—5月份和9—10月份采集的卵母细胞,其体外成熟率为66.0%、69.6%;6—7月初采集的卵母细胞,其体外成熟率最差,为54.7%。3.比较了OM液pH值对卵母细胞体外成熟的影响。当OM培养液的pH值为7.2和6.8￣7.0时,卵母细胞成熟率的为66.2%和61.0%,显著高于pH≥7.5时的成熟率(50.9%,P<0.05)。     

过表达cdc20基因对绒山羊卵母细胞体外成熟的影响

为研究过表达cdc20基因对绒山羊卵母细胞体外成熟的影响,构建了Myc-cdc20载体,在体外转录成cRNA后显微注射到绒山羊卵母细胞中,观察其对绒山羊卵母细胞体外成熟过程的影响。结果表明,在对照组卵母细胞体外培养的过程中,卵母细胞培养到8 h后发生GVBD,18 h后进入MⅠ期,直到24 h后,约75%的绒山羊卵母细胞排出第一极体。卵母细胞在GV期时显微注射g Myc-cdc20 cRNA,培养10 h后,通过Western Blotting的方法检测到了MYC-CDC20融合蛋白的表达。但统计结果显示,试验组卵母细胞各阶段发育时间和成熟率与对照并无显著差异。因此,单独过表达cdc20基因不影响绒山羊卵母细胞体外成熟过程。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液（含FSH）中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子（EGF）,24h检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明：添加10ng/ml、30ng/ml EGF组牛卵母细胞成熟率较对照组（未添加EGF）无显著差异（79.8% vs 71.5% vs 70.4%,p>0.05）,但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%（P<0.01）;在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml 、50ng/ml EGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率（P>0.05）,但可显著提高其囊胚孵化率（P<0.01）。     

Ghrelin对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响及其受体的表达模式

为探明Ghrelin及其受体Ghsr-1a在早期胚胎发育中的作用,以小鼠体内受精、体外受精和孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度Ghrelin,观察胚胎发育效率;通过免疫荧光染色和荧光定量PCR,观察不同时期胚胎中Ghsr-1a的变化。结果表明,体内受精胚体外发育中添加0.1 ng/m L Ghrelin显著降低了囊胚率(P0.05),添加1 ng/m L的Ghrelin显著降低了小鼠体外受精胚的囊胚率(P0.05)。在体内受精胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平在4细胞显著高于其他时期(P0.05);体外受精胚中,Ghsr-1a的mRNA水平在8细胞前无明显差异,桑椹胚和囊胚显著下降(P0.05)。在孤雌激活胚胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平从2细胞到8细胞显著降低,之后到囊胚期开始显著升高,其蛋白表达模式与mRNA表达模式相反。Ghsr-1a在体内受精和体外受精胚胎中的表达相似,囊胚期表达量最低。结果提示,Ghrelin能够抑制体内和体外受精胚的体外发育,不同来源胚胎Ghsr-1a mRNA和蛋白表达模式均不相同。研究结果为进一步探索Ghrelin在胚胎发育中的作用机制提供了试验基础。     

卵泡颗粒细胞维持山羊卵母细胞减数分裂抑制状态的研究

通过在卵母细胞体外成熟过程中添加不同浓度的卵丘细胞或其外围壁层颗粒细胞进行共培养,对山羊卵母细胞成熟过程中卵泡颗粒细胞对卵母细胞减数分裂抑制作用及作用机制进行了探索.结果表明,成熟液中添加105和106个/mL卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞的卵母细胞体外成熟率与对照组相比差异不显著(P>0.05),但添加5×106个/mL(41.2%)和107个/mL(24.6%)卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞组的成熟率显著降低(P<0.05);添加5×106和107个/mL卵丘细胞组和颗粒细胞组卵丘不能正常扩展,卵母细胞核状态观察,停留在GV期;Rp-cAMP(Rp-cyclic adenosine monophosphothioate)膜渗透性cAMP对抗剂,诱导了107个/mL的卵丘细胞组(71.6%)和外围壁层颗粒细胞组(71.3%)的卵母细胞体外成熟率与对照组(72.O%)差异不显著(P>0.05).在山羊卵母细胞体外成熟过程中,添加一定浓度的卵丘细胞及其外层的颗粒细胞可以提高卵母细胞胞质内的cAMP的水平,抑制卵母细胞减数分裂的启动,使卵母细胞停留在GV期.     

In vitro interspecific fertilization,embryo development and formation of hybrid seedlings between Gossypium hirsutum and G. arboreum

Summary In vitro hybridization between Gossypium hirsutum, and G. arboreum was carried out. Hybrid seedlings were obtained after successive use of the following five kinds of media: 1) pollen grain germination medium, 2) double-fertilization medium, 3) embryo development medium, 4) seedlings formation medium, 5) green seedlings growth medium. The factors affecting in vitro interspecific fertilization, embryogenesis and seedling formation were studied. The key factors were temperature and relative humidity (RH). The optimum RH for in vitro interspecific fertilization was 65%, and a suitable temperature range was 26–30°C. Pollen grain germination ratio decreased rapidly at a RH of 80%. When the temperature and the RH were higher than 32°C and 80%, respectively, the fertilization rate decreased to zero.Effects of petals and calyces of the maternal flowers on in vitro interspecific fertilization and ovule growth were identified. Even though the petals or calyces were excised, hybrid plantlets were also obtained after media were improved and a shake culture was used. In addition, the process of double-fertilization and embryo development were studied cytologically. The developmental characteristics of the hybrid embryos derived from in vitro interspecific fertilization were a later occurrence of the double-fertilization process and a much lesser division of endosperm cells. But the embryo development was not affected by these characteristics, and young hybrid embryos can develop to their cotyledon stage finally on artificial media.     

喷施赤霉素对甜高粱控蘖效果的影响

为了研究喷施赤霉素溶液对甜高粱田间分蘖数和倒伏的影响，试验以‘晋甜杂3号’为试验材料，分别于2~6叶期5个时期叶面喷施浓度为50、100、150、200、250、300、400、500、750、1000 mg/L的赤霉素水溶液，喷施清水作为对照。结果表明：喷施赤霉素后，甜高粱苗期分蘖数显著减少，不同处理时期间，6叶期分蘖数最少；在5个喷施时期内，处理间最少分蘖数分别较对照减少32.2%、30.6%、25.8%、43.5%、89.5%，最佳控蘖浓度均在250~300 mg/L范围内；相关性分析表明，苗期分蘖数与田间倒伏率呈显著正相关，与产量呈极显著正相关；喷施赤霉素可以显著增加甜高粱生物产量，但是控蘖效果越明显增产效应越弱，且本试验各处理并未造成减产。因此，甜高粱6叶期喷施250~300 mg/L的赤霉素水溶液可以有效控制甜高粱苗期分蘖数，增加其抗倒伏性，并且较对照产量保持稳定。     

超级杂交稻与常规稻剑叶维管组织结构比较研究

以3个超级杂交稻组合P88S/0293、Ⅱ优明86、两优培九并结合三系杂交稻汕优63、常规稻湘州8号为对照材料，在抽穗期通过对各材料剑叶维管组织石蜡切片显微结构比较分析，发现超级杂交稻组合中负责光合同化产物运输的维管束数量多，承担有机物运输的韧皮部面积在整个维管束面积中占较大比例，其有利于光合产物的有效运输；供试各超级杂交稻组合植物维管组织结构具有明显的C3植物特征，在同化物运输有关的一些方面具有优势。     

国内外8个不同种源地莲(Nelumbo)的成熟胚离体培养比较

建立高效获取无菌莲胚外植体的消毒体系,了解不同种源地莲的离体培养生长差异,为今后构建莲的优良离体培养及遗传转化体系提供可靠的材料和评估方法。使用不同浓度植物保护混合剂(plant preservative mixture,PPM)预培养法确定适宜的莲子消毒体系和无菌莲胚获取方式;在此基础上获得国内外9个种源地莲的成熟胚离体培养幼苗,通过观测其在不同培养时期的形态指标,利用隶属函数法综合评价其离体条件下的生长差异。研究发现,莲子比较理想的消毒体系为75%酒精消毒30 s + 2% PPM消毒2 h + 0.05% PPM浸泡催芽3~5天。其中,8个参试种源地莲的离体生长差异主要体现在培养后期,表现在展开叶数、茎节长度和粗度、根数及侧芽数等指标上。在相同培养条件下,越南莲和泰国莲的生长势最好、繁殖率较高。使用PPM浸泡成熟莲子进行预培养以获取无菌莲胚的方式,克服了以往莲子消毒不理想的技术难题。热带、亚热带分布的越南莲和泰国莲的离体无性系生长势强,是构建莲再生体系和遗传转化体系的良好原材料。     

母源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

为研究母源性印记基因Magel2、Sgce、SNRPN在牛早期胚胎中的表达规律,初步判定其印记发生的阶段。利用Real-time PCR技术,检测了这3个基因在牛孤雌激活 (Parthenogenetic Activation,PA) 胚胎和体外受精(In vitro Fertilization,IVF)胚胎中的表达水平。结果表明：在牛IVF和PA 2种胚胎间,3个母源性印记基因的印记表达模式明显不同,Magel2在牛IVF胚胎各阶段都有表达,而在PA胚胎中没有检测到表达信号;Sgce在牛IVF胚胎各阶段都有表达,而只在PA胚胎的2~4细胞阶段检测到表达,在其他发育阶段均没有表达;SNRPN在牛IVF胚胎各阶段都有表达,而只在PA胚胎的2细胞和囊胚阶段检测到很微弱的表达。实验结果表明,母源性印记基因Magel2、Sgce、SNRPN的正常表达对牛早期胚胎发育具有重要作用。     

Cytological Evidence for Fertilization in Hexaploid Wheat × Sorghum Crosses

Crosses were made between the hexaploid wheat ‘Chinese Spring’ (2n = 42) and the diploid grain sorghum ‘S9B’ (2n = 20). Sixty-nine out of 100 florets fixed 48 h after pollination contained an embryo, an endosperm, or both, a remarkably high frequency in view of the taxonomic distance spanned by the cross. Percentages of single or double fertilization ranged from 50 % to 91 % for individual spikes. The hybrid origin of the embryos was confirmed by examining zygotes from spikes fixed 25 to 27 h after pollination. Seven of the 8 zygotes in which chromosomes were sufficiently contracted to be counted contained 21 large wheat chromosomes and 10 much smaller sorghum chromosomes. The eighth contained 21 chromosomes from wheat and 20 from sorghum. Sorghum chromosomes did not appear to be attached to the spindle in zygote nietaphases and showed no evidence of movement towards the spindle poles in the single zygote anaphase found. Embryos with two or more cells invariably contained one or more micronuclei and metaphases in embryos with three or more cells contained only 21 wheat chromosomes showing that sorghum chromosomes were rapidly eliminated. Endosperm, when present, was always highly abnormal.     

Efficient In Vitro Shoot-regeneration Systems in Cassava (Manihot esculenta Crantz)

Two different protocols for in vitro regeneration of cassava using zygotic embryos and nodal axillary meristems have been developed. In both cases, buds were regenerated directly from excised explants without an intervening callus phase after a two-step culture procedure. In cotyledonary explants derived from zygotic embryos, prolific shoot formation occurred within 2—3 weeks on MS medium supplemented with 0.5—5 mg/1 BAP alone or in combination with 0.1 mg/1 NAA. Nodal explants with axillary meristems derived from aseptically grown seedlings or stem cuttings were used to initiate a round compact bulb-like structure on MS medium containing 10 mg/1 BAP. These latter structures, when cultured on MS medium supplemented with 0.1 mg/1 NAA, 1 mg/1 BAP and 0.1 mg/1 GA₃, produced multiple shoots. Somatic embryos isolated at the globular/torpedo stage from zygotic embryo explants were also capable of multiple shoot production on medium with 1 mg/1 BAP. Rooting of regenerated shoots exceeded 95 % in phytohormone-free MS medium. No change in their ploidy levels was observed. Therefore, the protocols developed should be of use in the particle gun and Agrobacterium-mediated genetic transformation of cassava.     

灰化时间对测定椰子叶中K、Ca、Na、Mg含量的影响

本文以椰子叶为材料,比较不同高温灰化时间对测定椰子叶中K、Ca、Na、Mg四种元素含量的影响。通过低温预灰化和不同时间的高温灰化处理后,利用原子吸收分光光度法测定样品中K、Ca、Na、Mg的含量。结果表明,测定椰子叶中的K、Ca、Na、Mg含量时,适宜高温灰化时间分别为2h、2.5h、2h、2.5h;同时测定该四种元素含量时,适宜高温灰化时间为2.5h。且2.5h高温灰化时,元素的平均回收率为95%一106.3%.     

杂交水稻中后期洪涝淹没与产量损失的关系

以4个杂交中稻品种为材料, 采用桶栽方法在模拟洪水和实地洪涝条件下, 研究了在水稻不同生育时期模拟洪水淹没的深度、时间对产量损失度的影响。结果表明, 淹没对产量损失度的影响为抽穗期>孕穗期>乳熟期, 淹顶>淹没植株2/3。洪水淹没下结实率和千粒重与淹没时间呈极显著负相关。在淹没植株2/3处理中, 孕穗期、抽穗期、乳熟期淹没100 h, 产量分别损失50%、60%、12%左右; 而淹顶处理100 h的产量损失度, 在孕穗期、抽穗期达100%, 在乳熟期不到25%。预测洪涝产量损失度分别达40%、60%和80%时相应的淹没时间, 建立了根据不同淹没时期和淹没深度的产量损失度与淹没时间关系模型, 决定系数为0.6038~0.9868。孕穗期、抽穗期和乳熟期分别在洪涝淹没56.3 h情况下, 产量损失度实测值与预测值误差为3.63~6.81个百分点, 可作为洪灾发生后评估水稻产量损失度的参考依据。