玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

作物叶片蛋白质组提取与酶切方法比较研究

蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液（pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、pH4.5醋酸盐）和TCA-丙酮处理对水稻、小麦、大豆和玉米叶片蛋白质提取的影响,同时以小麦叶片总蛋白和牛血清白蛋白为样本,比较了传统方法和微波辅助方法的酶切效率。结果表明,TCA-丙酮处理的小麦和水稻样品采用尿素/硫脲方法能获得较高的蛋白得率,而玉米和大豆样品采用尿素/硫脲直接提取时蛋白质得率更高,同时,微波辅助酶切值得用于蛋白质组样品制备。本研究采用适当的蛋白质提取和酶切方法,有效提高了蛋白质的提取率和鉴定率,可为进一步深入开展作物叶片的蛋白质组学研究提供借鉴。     

玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较

为比较不同方法提取的玉米叶片蛋白质对双向电泳效果的影响。采用TCA-丙酮沉淀和TRIzol试剂盒2种方法,提取国审玉米品种郑单958叶片全基因组蛋白质,并对提取的蛋白质样品进行双向电泳。结果表明:TCA-丙酮方法提取的蛋白质一向水平聚焦电压上升缓慢且达不到程序设置的电压,而TRIzol试剂盒方法实时监测图与程序设置图相吻合;对电泳胶图分析后可知,TRIzol试剂盒法分离出的蛋白点多于900个,低丰度蛋白质得到充分显现,大多数蛋白点分子量为20~80 k Da,p H值为4~7,蛋白点的形状较规则;TCA-丙酮沉淀法分离出的蛋白点仅有350个,表明样品中蛋白质分离种类较少,高丰度蛋白质过度显现,低丰度蛋白质检出率大大降低。     

萝卜蛋白组分析中叶片蛋白质高效提取方法

以萝卜‘NAU-JLQX09’叶片为材料,分别采用Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法和改进的PEG分级沉淀法提取蛋白质,通过双向凝胶电泳技术比较两种方法的效果.结果表明,应用Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白2-DE图谱可识别出640个蛋白点;而改进的PEG分级沉降法的蛋白组分(F1,F2以及F3) 2-DE图谱可清晰识别蛋白点数目分别为537,170与852,总蛋白点数目多且高丰度蛋白RuBisCO主要被沉降在F2中,F3中分离到更多的低丰度蛋白点.因此,在进行萝卜叶片蛋白质组分析时,采用PEG分级沉降法提取叶片蛋白,可获得较高质量的2-DE凝胶图谱.研究结果为应用蛋白质组学解析萝卜重要性状形成分子基础提供了良好的技术支持.     

宁夏枸杞中蛋白质的提取与鉴定

采用盐溶法提取宁夏枸杞中蛋白质,用饱和(NH4)2 SO4溶液进行分级盐析、透析、浓缩后用SDS-PAGE分析,测定不同提取液中主要蛋白质的分子量.结果表明:用pH为6.0的PB缓冲液提取,用饱和度为80％的(NH4)2SO4盐析时,枸杞蛋白的提取效果最好;经SDS-PAGE电泳后,初步鉴定出7种主要蛋白质,其中分子量为63 096 Da、51 286 Da、33 884Da的蛋白质提取范围较大.     

适用于蛋白质组分析的粉红单端孢菌蛋白提取方法的建立

为了优化一种适用于粉红单端孢菌双向电泳的蛋白质提取方法,以期为蛋白质组学水平研究粉红单端孢菌的致病机制奠定基础。以分离纯化后的粉红单端孢菌为试验材料,分别采用超声-TCA-丙酮、超声-磷酸-TCA-丙酮、超声-SDS、超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提和TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提等5种方法提取菌体蛋白质,通过对比分析蛋白质含量以及纯度筛选出2种较好的提取方法。在筛选聚丙烯酰胺电泳凝胶浓度的基础上,再通过双向电泳对比分析,得出最佳的蛋白质提取方法。结果表明,12%的聚丙烯酰胺凝胶浓度获得的单向电泳图谱背景清晰且无严重的拖尾现象,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得蛋白样品的质量浓度和含量分别为6.650 mg/mL和2.993 mg/g,该法提取蛋白通过SDS-PAGE分析条带清晰,双向电泳分析可获得1 238个独立清晰的蛋白点。由此可知,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得的粉红单端孢菌体蛋白适合于双向电泳分析及蛋白质组学研究。     

大豆DNA对玉米籽粒蛋白质含量的影响

报道了采用花粉管通道法转大豆DNA的玉米在自交选育2~3年后,玉米籽粒中的蛋白质含量变化。结果表明,大豆DNA可影响玉米籽粒的蛋白质含量。3个选出的玉米材料1DA5、5DB2和26DC1的总蛋白含量均比对照提高了3个百分点以上,使玉米籽粒的总蛋白质含量分别达到13.44%、12.84%、13.83%,且材料5DB2的醇溶蛋白在其总蛋白中所占的比例较对照降低了1.7%,而材料1DA5和26DC1的醇溶蛋白在其总蛋白中所占的比例均较对照明显提高。这说明,大豆DNA的转入引起玉米发生了不同的可遗传变异。     

圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳体系的优化

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明, TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0 mg g^–1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350 mg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

棉花叶片蛋白质组双向电泳技术的优化

 以棉花叶片为材料,针对试材中含有大量色素、酚、醌等干扰物质的问题,从蛋白提取方法、裂解液成分、上样量等方面对棉花叶片蛋白质组双向电泳技术进行优化。结果表明：采用改良的TCA/丙酮法提取棉花叶片总蛋白,含有7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲、4% CHAPS、80 mmol·L^-1 DTT、1 mmol·L^-1 PMSF、0.3%载体两性电解质的裂解缓冲液,上样量为600 μg,采用pH 4～7、24 cm的IPG胶条进行双向电泳时,2-DE图谱的蛋白点分布均匀、清晰且重复性好。本体系为开展棉花蛋白质组学研究奠定了技术基础。     

玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化

为了获得玉米籽粒双向电泳中蛋白质提取的最佳方法,建立最佳的玉米籽粒蛋白双向电泳技术体系,对酚抽提法、三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA/丙酮沉淀法)和可溶性蛋白提取法3种不同提取方法得到的蛋白质进行了分析,并在相同条件下进行双向电泳比对分析,结果表明:可溶性蛋白提取法获得的蛋白纯度高、浓度适中、双向电泳蛋白质点最丰富,最适合双向电泳研究;利用可溶性蛋白提取法获得的蛋白,对第一向等电聚焦参数等条件,以及不同p H值范围的IPG预制凝胶条进行了比较分析,结果表明:采用p H值3~10的IPG预制凝胶条时,采取电压梯度上升的方式,总聚焦70 000 Vhs、上样量800μg效果最佳,采用p H值4~7的IPG预制凝胶条时,总聚焦80 000 Vhs、上样量900μg效果最佳,并且采用p H值4~7的IPG预制凝胶条相比p H值3~10的凝胶条能分离到更多的点,最后结合蛋白质点MALDI-TOF-TOF质谱鉴定分析,建立了一套适用于玉米籽粒的蛋白质双向电泳技术方法,即采用可溶性蛋白提取法提取蛋白,采用24 cm、p H值4~7的IPG干胶条,上样900μg电泳效果最佳,等点聚焦程序:500 V、1 h,1 000V、1 h,2 000 V、1 h,4 000 V、2 h,8000 V、4 h,8 000 V、80 000 Vhs,500 V保持。试验研究为后续玉米籽粒发育差异蛋白研究奠定了技术基础。     

茶梅花瓣总RNA提取方法的比较和分析

本研究分别利用CTAB多级沉淀法、改良的异硫氰酸胍法、改良的热硼酸法、Trizol法和EASY spin植物RNA提取试剂盒法等五种方法提取茶梅花瓣总RNA,并进行了对比分析,发现EASY spin植物RNA提取试剂盒法是最为简单、快速、高效的方法,CTAB多级沉淀法次之。本研究为今后有效开展茶梅分子生物学研究提供技术便利,并为其它花卉植物RNA的提取提供必要的参考。     

鹿茸基因组DNA提取方法的比较研究

本研究旨在建立一种稳定、高效的鹿茸药材DNA提取方法,以满足后续的鹿茸DNA条形码鉴定方法需求。采用2种试剂盒、改良的CTAB法以及SDS法对市场上5个厂家共8批次的鹿茸药材进行基因组DNA的提取,参考2015版《中华人民共和国药典》四部通则9107考察了样品量、水浴温度、水浴时间3个因素。实验结果表明4种方法均可以从鹿茸药材中提取出基因组DNA,其中天根试剂盒提取效果最佳,改良的CTAB法提取效果较差;通过方法学考察得出使用天根试剂盒,提取条件为样品量70 mg、水浴温度56℃,水浴时间6 h时提取效果最佳。本研究优化得到的天根试剂盒提取鹿茸DNA方法操作简便,提取DNA浓度、质量优良,能够用于后续的DNA条形码鉴定中。     

甘蓝型油菜成熟籽粒DNA快速提取方法探讨

以室温保存不同年份的甘蓝型油菜种子为材料,采用改良的CTAB法和DNA抽提试剂盒分别提取甘蓝型油菜籽粒DNA,探讨适合甘蓝型油菜籽粒DNA提取的方法。结果表明,不同保存年份种子提取的DNA含量无显著差异;受种皮色泽的影响也较小;用改良的CTAB法比试剂盒所提DNA产量高,结构完整性好,成本较低。PCR扩增检测结果表明两种方法获得的DNA均能满足一般的分子实验。因此,从油菜干籽粒中直接提取DNA可以节约时间,显著提高工作效率,为快速高效地进行甘蓝型油菜种质资源和遗传多样性分析奠定了基础,同时,也利于快速鉴定推广品种是否带有外源基因。     

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质双向电泳体系的建立

为开展毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)的蛋白质组学研究,本研究对毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质提取方法和双向电泳参数进行了筛选和优化,以期建立适合毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳的实验体系。分别采用Tris-酚抽提法和TCA-丙酮法对毛尖紫萼藓总蛋白质进行提取,比较分析了两种蛋白质提取方法的效果,并研究了IPG胶条的pH范围及蛋白质电泳上样量等因素对毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳结果的影响。结果发现,在SDS-PAGE电泳结果中,与TCA-丙酮法相比,Tris-酚抽提法提取的蛋白质条带清晰,数目较多,完整性较好;在双向电泳结果中发现,与pH值为3~10的IPG胶条相比,使用pH值为4~7的IPG胶条的双向电泳图谱蛋白质点清晰且分布均匀,更适合毛尖紫萼藓的蛋白质组学分析;使用24 cm的pH值为4~7胶条,上样1200μg蛋白质时,电泳结果中可分辨的蛋白质点最多,且形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。本研究基于Tris-酚抽提法建立的毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳体系获得的蛋白质样品质量好,电泳分辨率高,为毛尖紫萼藓进一步的蛋白质组学研究提供理论参考。     

栀子高质量总RNA的提取

利用改进的高盐高pH值法和EASYspin植物RNA快速提取试剂盒,从富含次生代谢产物的栀子叶片和果实中提取总RNA。用紫外分光光度法和1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量,0.7%非变性琼脂糖凝胶电泳检测反转录产物质量,利用RT-PCR反应检测反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明,高盐高pH值法提取的栀子果实总RNA,试剂盒法提取的栀子叶片总RNA产量均较高,28S和18S条带清晰,28S条带亮度是18S条带的2倍,且A260/A280在1.9~2.0;以提取的RNA为模板反转录的cDNA长度范围较广(250~5000 bp);上述反转录获得的cDNA均能够成功用于60S核糖体蛋白L18A基因片段的扩增。综上所述,利用高盐高pH值法提取栀子果实总RNA、利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取栀子叶片总RNA,效果最好。本研究成功建立了从栀子果实和叶片中提取高质量总RNA的方法。     

顽拗植物龙眼果皮中总RNA的提取方法研究

[研究目的]为建立适于富含多糖和多酚等物质的龙眼果皮总RNA提取的方法;[方法]采用TRIZOL法、Tris-硼酸法和改良CTAB法提取龙眼果皮的总RNA,并通过凝胶电泳、紫外分光光度法检测提取的RNA样品的品质;[结果]改良CTAB法、Tris-硼酸法所提取的RNA经电泳检测,28SrRNA和18S rRNA条带清晰,RT-PCR得到的条带与目的片断大小一致,说明所提取的RNA纯度高、质量好;TRIZOL法所得到的RNA降解严重,没有得到完整的电泳条带;[结论]改良CTAB法和Tris-硼酸法适于富含多糖和多酚等物质的龙眼果皮总RNA的提取.     

鲜米糠中蛋白质的提取工艺研究

以新鲜米糠为原料,采用碱法、酸法、盐法分步对米糠蛋白进行复合提取。在提取过程中,以蛋白质提取率为指标,确定料液比、pH值、温度、时间对米糠蛋白提取率的影响,通过正交试验确定这3种方法各自提取蛋白的最佳工艺,最后依次采用碱提、酸提、盐提的最佳工艺条件分步对米糠蛋白进行提取。结果表明,碱法提取新鲜米糠蛋白最佳工艺条件:时间2.5 h,pH值12,温度30℃,料液比1∶11,提取率为34.49%;酸法提取新鲜米糠最佳工艺条件:时间3 h,pH值0.05,温度35℃,料液比1∶11,提取率为25.88%;盐法提取新鲜米糠蛋白最佳工艺条件:NaCl浓度0.6 mol/L,温度35℃,料液比1∶11,提取率为15.66%。复合法提取新鲜米糠蛋白总提取率达60.12%。     

一种改良的快速大量提取禾谷类作物成熟籽粒总RNA的方法

禾谷类作物成熟籽粒富含多糖、蛋白质和脂类等成分,传统的提取方法所得的RNA大多不能满足下游操作的需求。此实验利用一种改良的CTAB法对小麦、水稻、玉米成熟籽粒总RNA进行提取,实验步骤简单。RNA得率高,完整性好,电泳条带清晰,OD260/OD280值在1.6~1.8之间。RT-PCR和Northern印迹分析显示该法所提RNA能够满足下游实验操作的要求。进一步分析发现,这种改良的CTAB法对玉米籽粒RNA的提取效果优于小麦和水稻,更适于玉米籽粒RNA的提取。     

主栽金针菇品种中病毒的快速检测和鉴定

为了探索一种成本低、速度快、易操作、特异性强的dsRNA提取方法来检测金针菇中的病毒,并对目前主栽金针菇品种进行病毒的快速检测和鉴定。以各地主栽的金针菇品种为主要研究材料,采用试剂盒法和Redzol法2种方法检测dsRNA,将这2种方法进行比较,并通过反转录PCR和测序确定病毒种类。结果表明,试剂盒法和Redzol法均在主栽金针菇品种F-4889和F-4891菌丝体中检测到FvBV的病毒组分。与试剂盒法相比,Redzol法检测时间短,样品需求量小,易操作,成本较低,不需要繁琐的前期准备工作,适于实验室和大中型食用菌生产企业使用。Redzol法能从金针菇菌丝体中准确提取dsRNA病毒组分,并在主栽品种F-4889和F-4891菌丝体中成功检测到FvBV的病毒组分,为栽培生产、优化市场种质资源、育种选材等提供了理论依据。