棉花生长素结合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及序列分析

生长素结合蛋白(ABP1)在植物细胞发育中起着重要作用.在ABP1蛋白的保守区设计引物,利用RT-PCR和RACE方法,首次克隆了棉花ABP1基因cDNA的3'和5'末端.测序及生物信息学分析表明,该基因cDNA全长824 bp编码190个氨基酸,它所编码的氨基酸序列包含植物ABP1蛋白家族的所有特征,被命名为GhABP1.棉花ABP1所包含的Box A,Box B和Box C区在植物ABP1家族中是高度保守的.它的C末端氨基酸残基WDE在蛋白质的折叠及ABP1在质膜上的功能活性方面都具有重要的作用.棉花ABP1的C末端带有KDEL残基区,这个KDEL区表明它被定位在内质网上.用Clustal W软件进行多重比对分析表明,棉花ABP1与拟南芥、向日葵、油菜、辣椒、甘菊的氨基酸序列同源性分别为72%,72%,71%,70%和70%.系统进化分析表明,棉花在进化上与萝卜、拟南芥和油菜聚为一类.序列分析表明此基因为生长素结合蛋白基因家族的新成员.     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

水稻谷蛋白的一个新基因克隆及表达分析

与其他禾本科作物以醇溶蛋白为主不同，水稻种子含有醇溶蛋白和谷蛋白两种主要蛋白质贮藏形式。其中，谷蛋白约占胚乳蛋白总量的70%~80%。水稻谷蛋白是由多基因家族编码合成的，到目前为止至少已克隆获得了9个全长cDNA，根据这些cDNA编码的氨基酸序列同源性可将谷蛋白分为A、B两个亚家族。B亚族谷蛋白成员富含赖氨酸等人体必需氨基酸，与稻米的营养品质直接相关，因此挖掘、利用B亚族基因成员对于改良稻米蛋白品质性状至关重要。本文报道了以32P标记的谷蛋白基因GluB-2 cDNA片段为探针筛选水稻胚乳cDNA文库获得1个新的水稻谷蛋白基因全长cDNA。序列分析显示该基因核苷酸序列共1588 bp，含有1个由495个氨基酸残基组成的开放阅读框，编码蛋白分子量约为56 kD。推导的氨基酸序列与其他已知谷蛋白基因家族成员间序列相似性介于57.8%~97.8%之间，并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高，因此命名为GluB-7（GenBank注册号AY987390）。Northern杂交显示，GluB-7具有高度的胚乳表达特性。     

亚洲棉腺苷酸环化酶结合蛋白基因GaCAP的克隆及序列分析

 在腺苷酸环化酶结合蛋白（CAP）的编码区两端设计引物,利用PCR方法,克隆了亚洲棉CAP基因DNA和cDNA序列。经测序及生物信息学分析发现：该基因DNA序列中存在9个内含子;cDNA序列全长1425个核苷酸,总共编码471个氨基酸残基,其序列特征包含CAP蛋白家族所特有的四个结构域,因此被命名为GaCAP。它的C末端氨基酸残基可以与Actin蛋白结合;N末端带有CAP蛋白特有的RLE残基区,可介导CAP与腺苷酸环化酶发生互作,因此,该蛋白可能参与细胞对信号的应答反应进而影响细胞骨架结构的生物过程。     

小麦和水稻auxin基因家族的生物信息学比较分析

根据测序获得的1条260 bp cDNA片段,通过预测发现其包含小麦植物生长素(AUXIN)基因的部分编码序列,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217的cDNA中扩增获得一条608 bp的cDNA片段,该基因序列数据库(GenBank)登录号为AY902381(基因)和(蛋白).编码202个氨基酸,预计蛋白的分子量为23.0 kDa,等电点为9.93.利用已经分离的小麦生长素(AUXIN)基因的保守序列为检索序列,对小麦和水稻中的AUXIN基因家族成员进行分析,利用这些基因编码蛋白序列构建系统发生树,查找在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列,分析了这些基因在细胞中的定位情况和蛋白结构的相似性,根据已知相似基因的功能,分析该基因有进一步深入研究的必要.     

紫花苜蓿铝激活苹果酸转运蛋白基因的克隆与亚细胞定位

为揭示紫花苜蓿耐铝机理,根据已知的紫花苜蓿(Medicago sativa L)与铝胁迫相关的EST序列,运用RACE技术获得了紫花苜蓿铝激活苹果酸转运蛋白基因的全长cDNA,命名为MsALMT1,这一全长cDNA为1 638 bp,包含一个1 344 bp的最大开放阅读框,编码448个氨基酸,BLAST比对发现,Ms...     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

牛BMP-15基因cDNA的克隆和序列分析

BMP-15基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用,克隆了牛BMP-15成熟肽编码区的cDNA序列并进行序列分析,旨在为BMP-15在牛繁殖性能方面的进一步研究奠定理论基础。根据其他物种BMP-15基因的保守序列设计特异性引物,扩增牛的cDNA序列。从牛卵巢中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出牛BMP-15cDNA序列。将此片段克隆到PMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,证实所克隆序列BMP-15为骨形态发生蛋白,符合骨形态发生蛋白基因的特征。序列分析表明,该cDNA包含有1 185 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码394个氨基酸,与绵羊、猪、人、小鼠等动物氨基酸序列比对发现同源性分别为98.5%,87.6%,74.0%,69.4%。     

小麦转录因子基因TaMYB70的分离和表达分析

为了探究小麦MYB转录因子基因TaMYB70的功能,采用同源克隆方法分离TaMYB70（MK024291）基因cDNA序列,运用生物信息学手段分析该基因序列特征,采用实时荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）检测其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,分离得到的TaMYB70部分序列长度为1 272bp,包含一个长度为1 008bp的开放阅读框,编码335个氨基酸残基。TaMYB70蛋白含有2个螺旋-转角-螺旋结构的Myb-type HTH DNA结合结构域。TaMYB70氨基酸序列与粗山羊草、二穗短柄草等植物MYB44同源性较高,与拟南芥R2R3-MYB转录因子第22亚族成员属于同一分支。qRT-PCR分析表明,TaMYB70在脱落酸胁迫下表达量升高,在PEG和NaCl胁迫下表达量下降,该转录因子可能参与小麦逆境胁迫应答。     

光裸星虫Sn-hsc70基因克隆及表达分析

旨在研究光裸星虫热休克蛋白70 (Hsc70)在卵子发生过程中发挥的作用,为深入认识光裸星虫卵母细胞发育的分子机制积累基础资料。以光裸星虫为材料,用RACE技术获得光裸星虫Sn-hsc70基因的cDNA全长。进行生物信息学分析得出,Sn-hsc70全长2508 bp,编码656个氨基酸;Sn-Hsc70蛋白为71.65 kDa亲水蛋白。同时还分析了该蛋白的保守序列、核定位序列、胞质定位序列、连续重复的四肽序列、三级结构、系统进化树及结构域。RT-PCR结果显示,Sn-hsc70在光裸星虫卵母细胞发育的各个时期的表达量差异显著(P < 0.05),整体呈单峰型;在体腔液发育时期(O1-O4),Sn-hsc70表达量迅速上升,尤其是卵黄旺盛合成期和成熟期(O3-O4)显著高表达;脱离体腔液后(O5-O6),Sn-hsc70表达量显著下调。研究结果表明Sn-hsc70可能在卵黄积累中发挥重要作用,与卵母细胞转录与蛋白质合成减弱等有关。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

棘孢木霉T4小分子疏水蛋白基因hyb2克隆及序列分析

为了深入研究生物防治菌棘孢木霉T4菌株小分子疏水蛋白hyb2的功能,基于已知小分子疏水蛋白基因hyb2部分cDNA序列设计引物,分别以棘孢木霉T4菌株菌丝体总mRNA和基因组DNA为模板,进行PCR扩增,克隆获得hyb2的全长cDNA和DNA序列,其GenBank接受号分别为JX014433和JX185070,cDNA序列编码区长度为321 bp,编码106个氨基酸。BlastP相似性分析表明该基因与深绿木霉的Tahyd5a (ABS59366)基因同源性最高为87%,SignalP信号肽分析表明N端第16和17个氨基酸中间有一个信号肽剪切位点(AFA||AP)。Pfam蛋白家族分析表明它属于hydrophobin_2 superfamily家族。将棘孢木霉T4菌株小分子疏水蛋白基因hyb2对深绿木霉ATCC74058基因组和绿色木霉Gv29-8基因组进行同源性搜索,在2个近缘种的基因组上分别获得9个和8个同源序列。其中,深绿木霉ATCC74058的hyb-a-7和绿色木霉Gv29-8的hyb-v-5疏水蛋白与棘孢木霉Hyb2相似性最高分别为87%和70%,2个序列分别位于深绿木霉ATCC74058染色体骨架5和绿色木霉Gv29-8染色体骨架22上。     

甜菜nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达

利用同源序列克隆方法从二倍体甜菜品种Ty7中获得氮素诱导nia基因片段,通过RACE技术克隆nia基因全长序列,该基因ORF长度2 718 bp,编码905个氨基酸,并已在GenBank上登录(EU163265),基因组中nia以低拷贝数存在。nia编码蛋白的等电点为6.12,推测分子量为102 kD,以NADH为电子供体。为揭示不同氮素形态和处理对甜菜nia基因表达的影响,采用半定量PCR方法检测不同氮素形态诱导nia基因mRNA的表达,同时测定酶活力。结果表明,当铵态氮诱导nia基因时,低浓度的铵离子能促进基因的表达,过高浓度的铵离子抑制基因的表达。当硝态氮诱导nia基因时,随处理浓度的增加,nia的表达加强,呈正相关关系。用30 mmol L^–1硝态氮诱导4 h后,nia基因表达达最高值,约在6 h后,表达明显下降。     

棉花亲环素基因(GhCYP1)克隆及在干旱胁迫下的表达分析

本研究从已构建的棉花(Gossypium hirsutum)干旱胁迫抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)cDNA文库分离得到一个含有植物亲环素保守结构域的EST片段,测序并结合cDNA末端快速扩增(5'-RACE)技术获得了1个779bp的cDNA序列。序列分析表明,该cDNA5'非翻译区为70bp,3'非翻译区为187bp,并含有一个编码174个氨基酸蛋白的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个亲环素蛋白,将该基因命名为为GhCYP1,序列提交到GenBank,登录号为GQ292530。半定量RT-PCR分析表明,干旱胁迫处理后,该基因在叶片中的表达量迅速提高,并在胁迫2h达到最高,这一研究暗示该基因的表达与棉花抗旱胁迫相关。     

彩叶草叶片cDNA文库的构建与分析

用植物(叶)总RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为1.2×106 pfu/ml,扩增总文库滴度为6.7×109 pfu/ml,重组率达到98%,插入片段在0.5 kb到2 kb之间,1 kb以上的占60%。通过PCR检测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR 及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了基础。     

小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。     

成熟期番茄果实cDNA文库的构建及SlHSP17.7互作蛋白的筛选

植物小分子热激蛋白(small heat shock proteins, s HSPs)是一种多样、古老的蛋白家族,分子量大小普遍在12~42 k D之间,包含典型的C端、N端和α晶状体蛋白域。s HSPs作为一种重要的分子伴侣在植物生长发育和响应逆境胁迫中起着重要的作用。本研究通过构建成熟期番茄果实cDNA文库,筛选与SlHSP17.7互作的蛋白,进而探索SlHSP17.7在果实发育进程中的分子机制。以Micro-Tom番茄绿熟期、转色期和完熟期果实cDNA为模板,构建番茄果实c DNA文库。构建pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选与其互作的蛋白,利用酵母双杂交实验验证互作关系。经检测番茄果实cDNA文库库容是2.2×10~6CFU,工作液细胞密度是3.6×10~7cell/mL,均一化程度>106,结果符合质控要求。将pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体转化Y2HGold酵母菌株检测发现,其无毒性和自激活现象,经筛选c DNA文库、测序及序列比对分析得到钙阳离子交换体SlCCX1-like蛋白,利用酵母双杂交实验验证发现二者存在互作关系。经PCR鉴定后,所建文库质量良好,文库的库容和文库滴度均符合建库要求,用pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选得到互作蛋白SlCCX1-like,为进一步研究在果实发育进程SlHSP17.7的生物学功能提供了保障。     

甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScD27的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新型植物激素,D27基因是独脚金内酯生物合成途径中最上游的调控基因,且该基因调控SLs的合成是一个可逆的过程。本研究根据水稻、玉米、高粱、二穗短柄草4种禾本科作物的D27基因核苷酸序列保守区域设计引物,以甘蔗品种ROC22的c DNA为模板,利用RT-PCR和RACE技术,从甘蔗中克隆出D27基因的c DNA全长序列,命名为Sc D27,Gen Bank登录号为KP987221.1。该基因序列全长1379 bp,包含一个867 bp的完整开放阅读框(ORF),编码288个氨基酸残基。Sc D27编码的蛋白质分子量为71.58 k D,理论等电点为5.04,是一种非分泌性蛋白,主要分布于叶绿体上,该蛋白的保守区可能具有2个锌指蛋白结构域(Zn F_TAZ和Zn F_A20),且不存在信号肽;该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与高粱、谷子、大麦、短穗二柄草等禾本科植物的D27氨基酸序列相似性在70%以上;Sc D27基因在甘蔗各组织部位均有表达,其中茎尖和腋芽中表达量较高,叶、茎和根中的表达较低。此外,Sc D27基因在甘蔗茎尖中的表达受PEG、盐胁迫、磷缺乏和营养缺乏的诱导,推测Sc D27基因是甘蔗独脚金内酯生物合成途径中响应非生物胁迫的关键基因。