参薯赤霉素途径基因的克隆与表达分析

参薯是薯蓣科植物,其块茎有较高的营养价值和经济效益。为探究赤霉素对参薯生长及结块影响,本研究对参薯组培苗进行赤霉素处理,统计与对照组相比结薯时间差异;并检测了赤霉素合成及降解相关基因GA20ox、KO、KAO、GA3ox、GA20ox,赤霉素受体GID1基因(4个)和信号传导的DELLA基因(4个)、SPY、SLY1等24个赤霉素途径基因的表达变化。RT-PCR结果显示赤霉素相关基因在叶、茎中都有表达,仅LSH基因在块茎中特异性表达。统计赤霉素处理参薯的结薯时间表明,赤霉素处理的参薯苗结块时间明显提前。RT-qPCR结果显示赤霉素处理后,4个GID1、GA20ox、DELLA2、SNE等基因表达在所有组织或部分组织显著下降,DELLA1和KAO1表达变化不明显,GRF2在块茎中表达上升。试验结果显示外源赤霉素添加对参薯结薯有诱导作用,且对内源赤霉素合成有一定的抑制,可能通过改变参薯赤霉素含量的平衡而提前进入结薯过程,为将来人工控制结薯时间提供科学数据。     

外源GA_3对葡萄花序伸长及赤霉素合成代谢相关基因表达的影响

本研究以阳光玫瑰葡萄为试材,盛花前1周使用外源GA_3处理花序,发现10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L GA_3均可显著促进花序的伸长,且花序伸长长度与赤霉素浓度正相关。试验进一步用液相色谱检测了不同时期穗轴中GA_3的含量,发现外源GA_3可以短时间内提高幼嫩穗轴中GA_3水平,在处理24 h时GA_3水平达到顶峰,且100 mg/L GA_3处理峰值最大,2 d时GA_3水平迅速回落。通过荧光定量PCR检测了编码赤霉素生物合成过程中第一阶段的关键酶CPS和第三阶段无活性赤霉素转化为活性赤霉素的关键酶GA20ox和GA_3ox的基因,结果显示这三个关键酶的基因呈下调表达,且GA_3处理浓度越高,基因表达水平越低。赤霉素代谢途径上编码负调控蛋白DELLA的基因与对照相比整体呈下调表达,且外源GA_3浓度越高,DELLA基因表达量越低。说明外源活性赤霉素GA_3严重抑制了内源赤霉素合成途径上关键基因的表达,间接抑制了内源赤霉素的合成;同时抑制了代谢通路上负调控DELLA基因的表达,促进花序的伸长。     

陆地棉中赤霉素合成途径关键酶基因的时空表达变化

为揭示赤霉素合成途径关键酶基因在棉花生长发育过程中的调控作用,利用实时荧光定量PCR方法中的相对定量方法,对中棉所49材料植株体内的赤霉素合成途径相关基因表达量进行了检测分析。结果显示,幼苗期茎组织内除GA2ox1基因外,其余各基因表达量相对较高。开花期根中GA2ox1、GA3ox1、GID1B,茎中CPS1、GA20ox1、GA3ox1、GID1B和叶中GA3ox1基因表达量上调;吐絮期根中GA2ox1和GA3ox1基因表达量上调,其余基因下调,茎中KS、GID1B基因表达量下调,其余基因上调,其中以GA2ox1上调幅度最大,叶中GA2ox1基因表达量下调,其余基因上调。结果表明,开花期,茎中GA20ox1基因的高表达为植株茎的伸长及果枝发育提供必要的活性赤霉素水平,GA3ox1基因可能与开花成铃有关;吐絮期,随着根茎组织的木质化,根茎中GA2ox1基因表达量逐渐升高以降低活性GAs合成,而叶组织中GA3ox1和GA20ox1基因表达量上调,则为棉桃生长发育与脱水成熟提供必要的激素水平。棉花通过改变植株体内赤霉素合成代谢途径关键酶基因的表达量来调控植株的生长发育,且随着生长发育的进行,各目的基因的表达量变化趋势存在一定差异。为深入研究赤霉素对陆地棉的调控机理提供了理论基础,有助于加快利用赤霉素进行品种改良与种质创新。     

棉花赤霉素不敏感矮化GID1同源基因的克隆和表达分析

作为赤霉素(GA)受体,GID1是其重要的信号传导组分。为研究GA在棉花发育(特别是纤维发育)中的作用,本文在EST序列的基础上克隆了6个棉花GID1同源基因(GhGID1-1~6)。多重序列分析表明,棉花GID1同源蛋白GhGID1-1~6与拟南芥和水稻的GID1蛋白高度同源,具有多个与GA和DELLA蛋白的结合位点以及激素敏感酯酶家族保守域HGG和GXSXG。定量RT-PCR分析表明,GhGID1-1~6基因在棉花不同器官和组织中表达水平有差异,其中GhGID1-1和GhGID1-2在花器官中高表达,GhGID1-4基因在纤维和根中优势表达。胚珠体外培养基中外加GA使GID1同源基因表达水平发生变化,GhGID1-1和GhGID1-2基因的表达水平明显受GA抑制。比较发现,在胚珠和纤维中优势表达的GID1同源基因不同,GID1基因表达水平随发育时期变化的趋势也不相同,表明棉花胚珠和纤维具有相对独立的GA信号识别系统。     

四倍体矮秆小麦拔节期赤霉素合成途径中关键酶基因表达分析

为研究四倍体矮秆小麦拔节期赤霉素(GA)合成途径中涉及的关键酶基因及其与植株矮化的关系,选择拔节期的矮杆番麦和四倍体矮杆小麦近等基因系ANW 16 D、ANW 16 F、ANW 16 G(分别含有Rht 14、Rht 16、Rht 18基因)以及作为对照的高秆小麦Langdon(LD)进行试验.取拔节期小麦穗下第一茎节节间(约0.5 cm),提取总RNA并反转录,对影响GA合成过程中的GA 20 ox、CPS、GA 2 ox、KAO、KO、KS、GA 3 ox、GID 1、GA-MYB、XET、GIP、GAI、RSG和14-3-3等关键酶基因进行实时荧光定量分析.结果显示,GA 20 ox、GA 2 ox、KAO、KO、KS、GA 3 ox、GID1、GA-MYB、XET、GIP、GAI、RSG在4个矮杆品系和高杆对照中均有表达.GA 20 ox在高秆小麦中的表达量高于矮秆小麦,GA-MYB与之具有相似的表达模式,说明GA 20 ox和GA-MYB基因的低表达影响了矮秆小麦拔节期赤霉素的合成,从而导致矮化性状.     

旱垂柳转录组测序及赤霉素在垂枝形成中的作用

垂枝作为特殊的林木形态结构,因形态优美在全世界被广泛用于绿化和园林景观而成为研究热点。国内外对垂枝植物的研究表明赤霉素在垂枝形成中起作用,但是垂枝形成的分子背景研究仍比较缺乏。本研究以旱垂柳(Salix matsudana var. pseudo-matsudana)的垂枝为研究对象,通过对旱垂柳在不同生长发育时期的叶片、茎尖和茎基部进行了转录组和数字表达谱测序研究,共获得71 474个Unigenes序列。将Unigenes与COG和KEEG数据库比对,与转录和信号转导机制相关的基因在旱垂柳中高度富集,最终确定8 359个差异表达的基因,其中427个基因与激素相关。进一步分析赤霉素相关基因得出,主要参与2条赤霉素合成途径,具有生物活性的GA4是合成途径中的主要产物,而且GA4在枝条中的含量显著高于GA1和GA3。参与赤霉素信号转导途径中的GID1B在旱垂柳中上调表达,以及在G1和G4生长期的表达量高于其他时期,而DELLA蛋白GAI在G2生长期以后下调表达,GID1B和GAI在旱垂柳的垂枝生长过程中可能起非常重要的作用。这些研究结果将有助于探索赤霉素在旱垂柳垂枝形成中的分子作用,可为林木形态的遗传改良提供基础理论依据。     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。     

外源ABA、GA_3对太子参皂苷含量及其生物合成关键酶基因表达的影响

为了探讨ABA、GA3对太子参皂苷生物合成的影响,该研究通过根灌ABA及其抑制剂氟啶酮(Fluridone)、GA3及其抑制剂多效唑(PBZ),利用酶标仪分光光度法测定皂苷和内源茉莉酸甲酯(Me JA)的含量,采用实时荧光定量PCR技术检测三萜皂苷生物合成关键酶基因表达量的变化。结果表明,太子参总皂苷总含量与其生物合成关键酶基因的表达呈现一致的变化趋势,外源GA3长期处理后太子参中皂苷的含量明显增加,太子参SE1和IPPI基因的表达量明显上调;施加外源ABA则降低了太子参总皂苷的含量,太子参HMGS、MDD、SS1、SS2和β-A28O各基因表达量均明显下调。因此,我们推测在太子参块根生长发育过程中GA3可能通过影响JA从而促进了皂苷的积累,ABA可能是通过抑制皂苷合成关键酶基因的表达进而降低皂苷的含量。此外,在块根发育的不同时期,ABA、GA对Me-JA的影响可能存在较大差异。     

大豆GmGBPl在GA调控开花过程中的功能分析

从大豆中克隆得到一个编码SKIP蛋白的基因,命名为GmGBPl。通过研究外施赤霉素对GmGBPl过表达拟南芥植株表型及相关基因表达量的影响,探讨了该基因在GA3调控开花过程中的功能。结果表明,过表达GmGBPl植株对赤霉素的敏感性加强,植株开花时间显著提早,开花相关基因的相对表达量明显提高,而与野生型相比,GA3生物合成途径关键酶基因GA3ox和GA20ox的相对表达量下降明显。初步证实GmGBPl为GA开花信号途径中的正向调控因子,负调节植物赤霉素的生物合成。     

大豆GmGBP1在GA调控开花过程中的功能分析

从大豆中克隆得到一个编码SKIP蛋白的基因,命名为GmGBP1。通过研究外施赤霉素对GmGBP1过表达拟南芥植株表型及相关基因表达量的影响,探讨了该基因在GA3调控开花过程中的功能。结果表明,过表达GmGBP1植株对赤霉素的敏感性加强,植株开花时间显著提早,开花相关基因的相对表达量明显提高,而与野生型相比,GA3生物合成途径关键酶基因GA3ox和GA20ox的相对表达量下降明显。初步证实GmGBP1为GA开花信号途径中的正向调控因子,负调节植物赤霉素的生物合成。     

大豆生长节间响应温度和外源GA诱导的赤霉素途径关键基因分析

为了解大豆节间在不同温度和外源赤霉素(gibberellicacid,GA)诱导条件下的表型变化规律,分析GA合成重要途径和挖掘调控节间的关键候选基因,本研究将大豆品种Charleston在培养箱条件和室外盆栽条件种植,进行不同温度处理和外源GA涂抹处理,利用徒手切片配合显微照相方法,分析大豆节间长度和细胞形态变化;利用液相色谱-质谱联机结合转录组测序方法分析大豆节间GA合成主要通路并挖掘调控节间生长的关键候选基因。结果表明在25℃和30℃条件下,外源涂抹不同浓度GA可以诱导大豆生长节间伸长,随着伸长量的增加,大豆节间都变得纤细。外源GA对细胞作用效果主要为促进伸长,对宽度影响不明显。高温处理对节间的伸长效果高于低温处理。本研究鉴定到GA2氧化酶基因在大豆生长节间表达和较高含量的GA19和GA53,及这2种GA下游的GA20 (活性GA前体),以及这条合成途径的活性GA产物GA3也被检测到都存在于细胞伸长区组织,说明从GA前体物质到GA53,再到GA19,通过GA20最终合成GA3是大豆节间生长的一条重要GA合成通路,进一步说明GA2氧化酶在大豆节间生长过程中有重要作用。挖掘到某些DE...     

Rht12矮秆小麦GA3ox基因的克隆与表达分析

赤霉素3-氧化酶(GA3ox)是赤霉素生物合成途径中的一种关键酶,在茎的伸长中起着重要的作用。为探讨GA3ox基因和Rht12矮秆小麦矮化之间的关系,本研究利用同源克隆方法分离得到了小麦品种中国春和宁98-2105(含矮秆基因Rht12)的GA3ox1和GA3ox2基因,并对其在茎的不同部位进行了表达模式分析。研究结果表明,小麦GA3ox1和GA3ox2均含有3个外显子和2个内含子,其编码的蛋白具有2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶典型的保守结构域,但中国春和宁98-2105的GA3ox1和GA3ox2之间存在部分碱基的差异。实时定量表达分析结果显示,GA3ox1和GA3ox2在中国春和宁98-2105茎的不同部位的表达趋势基本一致,但表达量具有较大差异,GA3ox1和GA3ox2在宁98-2105茎的倒一节结节中的转录水平显著高于中国春,推测宁98-2105中赤霉素的信号转导通路可能受到了影响,即矮秆基因Rht12可能影响了赤霉素信号的传导。本研究结果为进一步研究矮秆基因Rht12的致矮机理和利用提供了理论依据。     

两个百合品种的GA响应差异及GA合成关键基因的表达分析

百合是多年生草本植物,花色丰富,花型优美,在切花、盆栽观赏和城市美化等方面都有着很大用途。本研究以两个百合品种Lilium ‘Tiger Babies’和Lilium ‘Whistler’为试验材料,在种球从萌发出约5 cm新芽到生长至开花期喷施一定浓度的GA及PAC,观察其对植株生长的影响。结果表明GA处理后‘Tiger Babies’的株高、节间长较对照明显增加,而‘Whistler’的株高与节间长与对照相比没有明显变化。PAC处理对两个百合品种植株的生长发育都具有明显的抑制作用,对‘Tiger Babies’的抑制效果更为明显。经过GA和PAC处理,两个百合品种的种球鲜重和种球大小均有所轻微的影响。以两个百合品种不同生长时期的叶片的cDNA为模板,对赤霉素合成关键基因GA20OX、GA3OX和GA2OX基因进行了qRT-PCR分析。结果表明GA处理后,不同生长时期,两个百合品种中这3个关键基因表达量均小于CK,但‘Tiger Babies’中其表达量与CK相比差异较大,明显低于对照;而‘Whistler’中其表达量与CK相比差异不显著。PAC处理后,3种基因的表达量均显著高于CK,与GA处理后的结果相反。以上结果表明两个百合品种对外源喷施GA的响应有所不同外,存在一定差异。本研究为进一步研究植物生长调节剂在百合株型上的应用提供理论依据。     

外源GA3、ABA对种子发芽与亲本穗上发芽内源激素变化影响研究

以外源GA3和ABA处理种子和水稻亲本,研究GA3和ABA对水稻种子萌发及亲本穗上发芽的影响,结果表明,外源GA3处理后引起两者种子内源GA3升高,降低种子内ABA、IAA水平,提高了GA3/ABA比值;外源ABA处理,引起种子内ABA含量升高,降低GA3、IAA水平,GA3/ABA比值减少;种子萌发和穗芽形成过程中GA3含量、GA3/ABA比值对比,发现前者小于后者,而种子萌发率与穗芽率相比,前者远远大于后者,表明穗上穗芽形成是一个更为复杂的生理变化过程.     

油菜素内酯合成和信号转导基因在马铃薯块茎贮藏期间的表达变化及对萌芽的影响

为探明油菜素内酯BR在块茎萌芽中的作用,建立更有效的种薯催芽调控体系,选择了休眠期不同的3个品种,利用q RT-PCR分析与BR合成、信号转导、调控有关的9个基因在贮藏期间及抑芽处理下的表达模式;同时检测BR类似物24-表油菜素内酯(24-e BL)及其与赤霉素GA3对块茎萌芽的影响。结果表明,涉及BR合成的4个基因表达量均随贮藏时间延长升高,短休眠品种升高的时间点早于中、长休眠品种;信号转导及调控基因中BRI1和CYCD3的变化与合成基因相似,BSK和TCH4的表达量则在中、长休眠期品种中保持恒定。抑芽处理在贮藏前期能刺激这些基因的表达升高,但之后都迅速下降并保持低水平。转录因子BZR1在各品种中以及抑芽处理下均没有明显变化。24-e BL利于块茎解除休眠,但不促进芽的伸长生长,与GA3互配效果更佳,单株块茎增重37.92%~98.41%。结论表明,BR合成和信号转导是块茎从休眠向萌芽转变的必经生理过程,它与GA3互配用于催芽更利于种薯萌芽的整齐、健壮并促进块茎形成。     

赤霉素诱导甘蔗GA20-Oxidase基因实时荧光定量PCR分析

本研究以喷清水甘蔗幼茎作为对照（即未处理）,经过赤霉素处理后6h、12h、24h和48h的甘蔗幼茎为处理,分别进行取样并提取RNA,反转录获得cDNA作模板,利用SYBR GreenⅠ成功构建了目的基因（GA20-oxidase）和内参基因（GAPDH）的标准品和标准曲线。结果表明：内参基因与目的基因的起始模板浓度与Ct之间呈良好线性关系,决定系数分别为r^2=0.998、r^2=0.995;溶解曲线均显单峰型,证明扩增的特异性比较好,可对基因表达进行相对定量。定量结果表明：目的基因未处理的表达量最大,赤霉素处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,12h后逐渐上升,但到48h又明显下降,且所有处理的表达量均低于未处理,6h、12h、24h和48h比对照的表达量分别下降了24.75%、13.18%、10.23%和20.34%。本实验研究GA20-oxidase基因在赤霉素处理后的表达情况,为进一步克隆甘蔗GA20氧化酶基因全长序列、研究该基因在甘蔗节间伸长过程中的表达调控及甘蔗茎间伸长中的作用机理提供理论依据。     

低温促进白菜开花的效应分析

为了研究低温对白菜开花的效应,以普通白菜品种杭州油冬儿为试材,研究了萌动种子和幼苗低温处理对白菜开花及处理过程中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白质和内源激素含量的变化.结果表明,无论萌动种子还是幼苗低温处理都促进白菜植株开花;处理过程中,萌动种子与幼苗植株叶片的可溶性糖含量均升高,淀粉和可溶性蛋白质含量均下降,总的C/N值升高;萌动种子低温处理后植株的GA_3、IAA含量升高,而ABA含量下降,同时GA/ABA、IAA/ABA的值也升高,而GA/IAA的值却先下降后上升;幼苗低温处理使植株的GA_3、IAA和ABA三者的含量均升高,而且GA/ABA、GA_3/IAA,IAA/ABA的值也都升高.说明GA_3,IAA相对含量的增加有利于白菜的开花.     

烟草种子后熟对GA和ABA代谢与信号基因表达及萌发的影响

为了探索适宜的烟草种子后熟条件及了解其作用机理,本研究以‘K326’新采收烟草种子作为对照(CK),比较了恒温25℃、自然变温下后熟一个月及后熟两个月时期种子中GA和ABA代谢与信号基因表达差异。结果表明,新采收烟草种子存在光休眠,后熟有利于打破光休眠;自然变温较恒温25℃处理更有利于加速种子后熟;随着后熟时间的延长,不仅种子萌发率提高,而且萌发速度也加快。种子后熟过程中,自然变温处理NCED6的相对表达量均低于恒温25℃处理。无论常温还是变温处理,种子后熟两个月后GA3ox2和CYP707A1的相对表达量较后熟一个月显著升高,而GA2ox2、ABI3、XTH2和TOC1显著降低。综上所述,在后熟过程ABA代谢和信号被抑制,而GA合成和信号被激发,从而加速种子后熟和促进其萌发。本研究结果为后熟作用释放烟草种子光休眠的现象提供理论依据。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

参薯DELLA基因家族鉴定及分析

DELLA基因家族是参与赤霉素信号调节过程的负调控因子,DELLA常与其他转录因子结合,通过影响这些转录因子起作用。为了解析参薯中DELLA基因家族的调控网络,本研究对参薯DELLA基因家族进行鉴定,对其理化性质、系统进化树、保守基序、亚细胞定位预测,赤霉素处理后基因转录谱、互作转录因子进行分析。研究发现,参薯DELLA基因家族包含4个家族成员,都为酸性蛋白。系统进化树分析发现DaDELLA2与拟南DELLA基因处于同一分支,保守基序分析发现除DaDELLA4外,都含有10个蛋白保守序列,DaDELLA定位主要分布在细胞质和细胞核中。根据转录谱发现,赤霉素处理15 d和60 d后,转录因子DaAP2.7-LG16在块茎中表达量最高。分子实验表明DaDELLA2自激活发生在DELLA蛋白N端,与DaAP2.7-LG16存在互作,且互作用主要发生在DELLA蛋白的N端。以上研究对参薯DELLA蛋白基因家族进行初步分析,为进一步的研究提供基础。