海岛棉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与定位

植物R基因产物存在非常类似的结构域，如NBS、L,RR、STK、LZ、TM、TIR等。依据保守序列设计引物寻找抗病基因类似物(Resistance Gene Analog，RGA)，从而定位或克隆抗病基因在理论上是可行的，这种方法称为R基因同源克隆法。RGA往往与已知抗病基因具有很高的相似性，均含有LRR、NBS或蛋白激酶中的保守基序，有的与已知抗病基因连锁，或是抗性基因家族中的成员，抑或与已知抗病基因无关，它们最有可能参与植物抗病反应过程中的信号识别、信息传导等途径，并且与植物抗病基因具有密切的关系，但RGA并非等同于植物R基因。将RGA作为分子标记整合到植物分子连锁图谱中，或将其作为探针筛选基因组文库，获得候选抗病基因则不失为一条克隆基因的捷径。利用已知R基因的保守序列设计引物进行PCR扩增，已经在植物中分离到了许多与已知R基因同源的DNA序列，并且有很多RGA作为标记定位在抗病位点附近，有点被证明与抗病性状共分离。小麦抗叶锈基因Lrl0的分离是利用该方法进行抗病基因克隆的首次报道。本研究依据N，L6，RPS2等NBS类抗病基因的NBS保守区设计简并性引物扩增棉花基因组DNA，在517bp左右获得特异性扩增条带。回收PCR产物，连接转化共得到800个克隆。经酶切筛选、嵌套引物鉴定获得252个候选RGA克隆。测序后获得11条RGA序列，这些序列的大小在500—527bp之间，其中3条序列中含有1或2个终止子。所有11个RGA序列都含有NBS保守区的Kinase海岛棉1a(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3a(GSRII)及跨膜区(GLPLA)等保守结构域，与已知抗病基因的保守结构具有较高的吻合程度。本研究所获得的RGA与大豆、棉花、腰豆等作物中已经克隆的NBS类RGA的核苷酸序列有很高的相似性。其中8条可通读的RGA序列推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPMl、SRPS2、N表现出从25％——58％的相似性。本研究以海陆杂交F2群体作为定位群体，应用RFLP方法将获得的7条RGA序列定位在棉花基因组中。Gbrga2和Gbrga8定位于第11同源群的三个位点：连锁群1302的端点及连锁群A03距端点59．2cM处。在连锁群1302中与pAR286E4C标记定位在同一位点，与Unig22d03bE6D标记相距5．6cM在连锁群A03中与pARlllE3C标记共同定位在端点，同时定位在Unig26804E5D(22D)标记下游1．7cM处和Gate4DB08bE3D(14D)标记上游8．6cM处。Gbrga508和Gbrga535定位于第4同源群的两个位点，D染色体组的第20号染色体上距端点175．3eM处，与Unig27A04E5C标记和M16—118E1C标记分别相距2．7cM和3．8cM；Gbrga508和Gbrga535同时还定位于A染色体组第5号染色体上距端点142．9cM处，与G1025aE5C标记和Gate2CFllE3C标记相距2．6cM和1．2cM。Gbrga522，Gbrga568和Gbrga39定位于第4连锁群D染色体组的第20号染色体上距端点5．5cM处。与Unig24H03E6C标记和P13—6E3D标记分别相距1．0cM和2．0cM。海岛棉RGA的获得、在基因组的定位，对于棉花NBS类R基因的起源和进化，利用分子标记辅助育种以及棉花抗病基因的克隆，提供了重要的背景。     

植物抗病分子机制研究进展

近十年来，植物抗病基因及其病原无毒基因的克隆，为在分子水平上揭示抗病基因的作用机制奠定了基础。本文综述了抗病基因作用的主要遗传基础模式，病原无毒基因及其蛋白产物的结构功能研究、植物抗病基因介导的信号传导以及抗病基因的潜能开发与应用，并对研究植物抗病机制的前景作了展望。     

RGA法克隆候选抗病基因的研究进展

RGA法是克隆植物抗病基因的一条新途径,也是近年来分子生物学领域的一个研究热点并受到植物病理学家广泛地关注。其作用原理是根据已克隆植物抗病基因的保守结构域设计简并引物,扩增获得RGAs,然后分析RGAs与抗病基因的关系,确定候选抗病基因并从而获得新的抗病基因。研究还发现,已克隆的RGAs与R基因紧密连锁。最近获得的RGAs主要是根据。NBS-LRR和STK两种保守结构域而得到的。前者在植物基因组中广泛存在,而后者在植物信号传导中具有重要作用。为此,本文主要对上述两种保守结构域的结构特点和所获得的RGAs特点以及RGA法的应用前景进行了综述,以期让人们对RGA法有更进一步的认识。     

柑桔抗病分子育种研究进展

本文综述了柑桔抗病分子育种近年来的研究动态和所取得的研究成果。柑桔分子育种始于上世纪90年代,以期克服常规育种面临的多方面严重阻碍,如杂种不育、杂交不亲和、较长的童期和大的树体积,以及随之而来的用地和巨大的人力、物力、成本等;其相对较小的基因组已使其成为果树分子育种研究领域的模式植物之一。首先在利用富有目标抗病基因的柑桔近缘属枳(Poncirustrifoliate)作亲本,培育杂种群体,开发分子标记与连锁遗传作图等方面取得突破,同时在基因组BAC文库与物理图谱的构建、抗病基因的克隆、遗传转化体系的建立、外源抗病基因及候选抗病基因的转化等诸多方面也已取得长足进展,并已摸索出适合柑桔基因工程操作的一整套方法。此外,本文对柑桔基因组的候选抗病基因转化及抗病基因工程研究中存在的问题也进行了讨论与分析。     

水稻白叶枯病抗性基因和相关因子研究利用进展

水稻白叶枯病严重制约水稻生产,抗病基因的发掘与利用是目前防治该病害最环保有效的手段。为高效发掘、研究和利用抗白叶枯病基因,本文概述了白叶枯病菌与水稻的互作机制,总结了抗白叶枯病基因的定位与克隆现状并对其功能类型加以分类,归纳了抗病相关因子的研究进展。针对目前抗白叶枯病基因的研究进展缓慢且概述性研究报道相对滞后的现状,提出研究展望,认为应更深入研究水稻抗白叶枯病基因的定位克隆与利用,并大力探究抗病基因与抗病相关因子的协同作用关系。     

植物抗病基因研究进展

分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用，为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。近40个植物抗病基因结构与功能的明确，有利于深入研究病原菌与寄主之间的相互作用关系，制定更为有效的植物病害防治措施。本文对植物抗病基因的克隆策略、结构与功能、抗病分子机制，以及植物抗病基因在转基因分子育种中的应用前景进行了综述。     

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。     

植物数量抗病基因克隆及其抗性机理的研究进展

培育广谱、持久抗病的作物品种，不仅需要深入研究质量抗病性，而且需要更深入地洞悉数量抗病性的可能作用机理。而目前，人们对数量抗病基因的可能特征和数量抗病性的机理的认识还相当模糊，这在很大程度上限制了数量抗病基因在育种实践中的应用。本文首先综述数量性状座位（quantitative trait loci，QTL）的克隆策略和精确获取数量抗病性状值的方法；其次根据数量抗性座位（quantitative resistance loci。QRL）的相关研究进展，对QRL的可能特征进行一定的综述，认为部分QRL的抗性机理直接对应于R基因、抗病基因类似物（resistance geneanalogs，RGA）、防卫基因、防卫反应途径中的相关基因等在植物抗病性上的作用机理；最后，作者推测存在4种抗性特征的QRL，即小种特异性或非特异性QRL和“病原菌”特异性或广谱性QRL，并认为数量抗性持久性的遗传基础与这些不同特征的QRL间有着密切的联系。该综述将对QRL的候选基因分析和克隆、数量抗病机理研究和QRL的育种应用提供有益的参考。     

中国作物新基因发掘：现状、挑战与展望

中国作物新基因发掘是实现中国作物种质资源优势向基因资源优势转变和作物分子育种的基础。本文对中国近10年来水稻、小麦、玉米、大豆、棉花和油菜等主要作物基因发掘研究的进展进行了分析和评述。中国作物基因发掘也取得了一系列突破性进展：(1)创制出一批具有特色的基因发掘材料,包括基于中国作物遗传多样性的核心种质、基于优异资源的遗传分离群体和基于人工诱变的突变体等;(2)基因发掘技术和方法有所突破,尤其是在针对基因特点整合各种基因发掘技术、改进基因/QTL的生物统计算法等,提高了基因发掘的效率;(3)作物农艺性状的标记与基因定位已成为常规遗传研究方法,初步定位了一批抗病、抗逆、优质、养分高效、高产相关基因/QTL,其中,有500多个基因已精细定位;(4)以水稻为代表的作物基因克隆及功能研究在国际上受到瞩目,在主要作物中已克隆了300多个基因,其中,在目标作物中验证的基因数超过70个。在国际作物基因发掘高效化、规模化及实用化发展过程中,中国作物基因发掘也取得了重要进展。然而,中国作物基因发掘的数量和质量还远远不能满足作物分子育种的需求,与国际作物基因发掘也存在差距,具体表现为不同作物基因发掘研究进展不平衡、发掘基因的数量还相对有限、已发掘的基因中具有重大利用价值的基因不多。针对中国基因发掘面临的问题和世界各国以及跨国生物技术公司争夺基因的巨大挑战,作者提出了中国作物基因发掘应重点提高基因发掘效率,加强重要基因克隆及基因的价值评估,以生物产业发展需求为导向的基因发掘策略。     

三种野生稻候选抗病基因的克隆与分析

候选抗性基因克隆策略是克隆植物新抗性基因的重要途径.根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中的氨基酸保守区域,设计兼并引物,通过RT-PCR扩增、克隆和测序,从茶陵野生稻,东乡野生稻和小粒野生稻中共获得了11条NBS-LRR类抗病基因同源序列.通过聚类分析可将同源序列分为3类,其中茶陵野生稻中得到1类,东乡野生稻中得到2类,而小粒野生稻中得到3类.但是小粒野生稻包含有其他两种野生稻的序列.三类序列都与水稻抗病基因RPR1具有较高的同源性,有一类氨基酸序列同源性甚至高达88%,可能为其家族成员.利用电子定位将三类序列定位在水稻基因组11号染色体上RPR1附近.根据序列比对分析结果认为其中可能有1～2个新抗病基因.     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的克隆及遗传转化

为了构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的植物表达载体并对其进行遗传转化,以水稻白叶枯病抗性品种‘扎昌龙’(ZCL)的基因组DNA为模板,通过长片段PCR扩增得到水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因Xa31(t)-1和Xa31(t)-2的序列,采用酶切、连接的方法先将目的基因克隆至T载体,筛选正确的质粒后,再克隆至pCMABIA1300表达载体。以农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入‘日本晴’和‘台北309’的愈伤后诱导成苗,获得了大量转基因植株,这些工作为克隆白叶枯病抗性基因并研究其功能奠定了基础。     

拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

（1云南师范大学生命科学学院,昆明 650092;2丽江市环境监测站,674100）     

苹果轮纹病抗性候选基因的表达分析

轮纹病菌侵染苹果植株,使树体减弱,严重影响苹果产量和品质。研究苹果轮纹病抗性候选基因的表达分析,以期为揭示苹果轮纹病的抗病机制提供参考。本研究以河北农业大学苹果课题组筛选出的抗病株系‘1-1-46’和感病株系‘1-1-40’为试材,对枝条接种轮纹病菌(B.berengeriana f.sp.piricola)和空白培养基,观察0~40 d内枝皮中的轮纹病抗性候选基因的表达量。结果表明:接种轮纹病菌后感病株系‘1-1-40’可以观察到明显的病变现象,皮孔凸起呈瘤状,抗病株系‘1-1-46’无明显的变化。对枝皮进行抗病候选基因Mdcf3、MdMBP2(苹果甘露糖结合蛋白)和MdACBP2(苹果酰基辅酶A结合蛋白)的表达分析,结果表明,接种轮纹病菌后,Mdcf3基因的相对表达量感病株系‘1-1-40’低于抗病株系‘1-1-46’,MdACBP2基因和MdMBP2基因相对表达量抗病株系‘1-1-46’低于感病株系‘1-1-40’。由此认为,对一些试材测定基因的相对表达量可以作为植株抗、感性鉴定的参考评价指标。     

广西水稻地方品种核心种质稻瘟病抗性位点全基因组关联分析

稻瘟病是水稻重要病害之一,严重影响水稻的产量与品质。培育抗性品种是防治稻瘟病最经济、环保的方式。稻瘟病抗性基因的鉴定与挖掘是开展抗病育种的基础与前提。本课题组前期对419份广西水稻地方品种核心种质进行简化基因组测序,获得208,993个高质量SNP标记。本研究采用苗期喷雾接种方法,研究了该419份核心种质对7个稻瘟病生理小种的抗性,并根据表型和基因型数据,利用一般线性模型(general linear model,GLM)和混合线性模型(mixed linear model,MLM)进行全基因组关联分析。2种模型下共检测到20个位点,其中GLM检测到20个位点,MLM检测到1个位点,Chr12_10803913位点在2种模型下都检测到。17个位点与前人定位的基因/QTLs重叠,其余3个是新位点,分别为Chr3_18302718、Chr3_18302744及Chr5_10379127位点。在20个显著关联位点上下游各150 kb的基因组区域中共筛选出候选基因323个,初步确定8个候选基因与抗病相关,其中LOC_Os12g18360(Pita)、LOC_Os12g18729(Ptr)为已知克隆的基因,LOC_Os03g32100、LOC_Os03g32180和LOC_Os05g18090为新位点附近筛选到的候选基因。本研究结果为稻瘟病抗性位点挖掘与稻瘟病相关基因克隆提供了科学依据。     

植物抗性相关基因的研究

植物广谱抗性反应中，特定的抗性基因通过细胞信号转导高度表达。应用图位克隆、转座子标签、微卫星标记等技术从一些主要的经济作物和园艺植物中定位和克隆了大量抗性基因。R蛋白是一类重要的Pr类蛋白，往往具有若干相似结构域，R蛋白结构和序列分析对抗性基因家族分类、抗性信号转导机制研究有重要意义。Avr基因研究的成果进一步证实了“基因对基因”学说。根据抗性细胞信号转导机制的研究，发展形成了激发子一受体学说、细胞防卫学说等一些新的植物抗性机制假说。目前已有十几种动植物、微生物的外源抗性基因应用于转基因植物研究中。     

玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性基因的挖掘

玉米穗腐病是一种严重危害玉米生产的真菌性病害,而目前在世界范围内玉米育种上应用的大多数自交系缺少对穗腐病的抗性。玉米穗腐病抗性位点的挖掘和抗病基因的克隆,对玉米穗腐病的遗传改良至关重要。本研究旨在通过转录组测序和全基因组关联分析的方法进行玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性位点的挖掘并初步确定候选基因。抗病自交系法A和感病自交系掖81162的转录组测序结果表明,人工接种拟轮枝镰孢菌后7d两个自交系的差异表达基因有10,761个。通过全基因组关联分析共检测到5个与穗腐病抗性显著相关的SNP,这些SNP分布在1号和9号染色体上。通过比对B73 RefGen_v3并注释,发现SNP位点附近涉及的基因包括酰基激活酶1过氧化物酶体、蛋白磷酸酶2C 48、镁转运蛋白、受体蛋白激酶CRINKLY4和锌指CCCH域蛋白19。将在转录组测序中获得差异表达基因和全基因组选择中关联到的基因进行比对,发现全基因组关联分析中关联到的锌指CCCH域蛋白19同时也是转录组测序中获得的差异表达基因,表明锌指CCCH域蛋白19可能与玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病的抗性相关。本研究结果不仅能为抗病基因的克隆和玉米的抗病分子育种提供一定的理论依据和重要的遗传资源,而且能为玉米和病原菌的相互作用机理的解析奠定基础。     

海岛棉转录因子EREB5基因的克隆及特征研究

 近年来,ERF (Ethylene-responsive element binding factor) 家族转录因子已成为植物抗逆、抗病的分子机制和作物分子育种研究的热点。本研究以电子克隆、同源扩增和RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术相结合的方法从海岛棉中分离出了一条新的ERF族转录因子基因,命名为EREB5。该基因包含一个573 bp长的开放阅读框,预期编码190 aa长的蛋白质分子。序列分析表明该蛋白除含有一个ERF保守域外,还含有一段核定位信号序列、一段富丝氨酸的激活域、多种磷酸化位点和一个土豆抑制子Ⅰ型家族基序等。构建系统发育树分析表明该因子属于ERF亚家族B3亚组。瞬时表达实验证明该因子定位于细胞核内,同时,凝胶阻滞实验结果说明EREB5蛋白和GCC盒具有较强的结合能力。再者,荧光定量PCR结果表明乙烯和黄萎病菌处理可以诱导该基因的表达。这些结果暗示EREB5蛋白很可能在黄萎病抗性机制中扮演者重要角色。     

水稻抗稻瘟病基因Pi47的精细定位和候选基因分析

不断挖掘和克隆抗稻瘟病新基因, 是解析水稻抗病分子遗传机制和培育抗稻瘟病新品种的重要基础。Pi47是笔者从广谱、持久抗稻瘟病湖南地方品种湘资3150中鉴定的稻瘟病抗性基因, 前期研究将其初步定位于第11染色体标记RM224和RM5926间。本研究利用3个Pi47单基因系与感病亲本CO39杂交F₂群体1687个感病单株对Pi47精细定位, 利用6个STS标记对3个单基因系进行背景分析, 采用生物信息学方法进行了候选基因分析。结果表明, Pi47被精细定位于CAPS标记S32与K33间0.24 cM区域的171.2 kb物理区间内, 背景分析将Pi47进一步缩小至SC12和K33间67.8 kb的区间内; 该区间含有8个结构基因, 其中2个编码NBS-LRR抗病类似蛋白, 为Pi47的候选功能基因。稻瘟菌抗谱比较分析发现, Pi47单基因系与其定位区间内4个Pik位点的等位基因Pik、Pikm、Pikh和Pikp的近等基因系抗谱不同。这些结果为进一步克隆Pi47和利用其进行分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品种奠定了基础。