薯蓣属28种山药psbA-trnH序列系统学分析

通过分析山药28个不同样品的psbA-trnH序列,研究山药亲缘关系和系统进化关系。采用分子生物技术方法对不同来源地的28种山药资源进行PCR扩增、测序,通过构建系统发育树分析不同样品psbA-trnH片段的长度、变异位点、G+C含量、系统关系。扩增psbA-trnH长度在382~409 bp,GC含量在36.0%~34.72%之间,利用MEGA6.0计算核苷酸变异位点193个,信息位点183个保守位点226个。通过系统进化树的构建把不同产地山药样品分为2类。实验证明psbA-trnH片段能够处理种间的系统发育关系,对不同产地之间的样品也有一定的区分能力,为今后的山药分类提供分子水平的依据,为下一步研究不同产地山药之间的亲缘关系和解决品种间的混淆问题奠定基础。     

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别巴戟天及其3种近缘植物

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别巴戟天及其3种近缘植物。对巴戟天及其3种近缘植物的ITS2和psbA-trnH序列进行PCR扩增和测序,运用遗传距离分析、DNA Barcoding Gap和系统发育(NJ)树3种方法对其进行鉴别。结果,巴戟天及其3种近缘植物的ITS2序列长度为237bp,GC含量为70.3%,保守率为86.08%,变异率为13.92%,ITS2序列上种间变异大于种内变异,存在较显著的DNA Barcoding Gap,其NJ树能准确鉴别出全部供试物种。巴戟天及其3种近缘植物的psbA-trnH序列长度为290bp,GC含量为20.2%,保守率为53.10%,变异率为46.55%,psbA-trnH序列上种间变异大于种内变异,无明显的DNA Barcoding Gap,其NJ树仅能准确鉴别出海滨木巴戟和羊角藤。ITS2序列的物种鉴定能力优于psbA-trnH序列。因此,基于ITS2和psbA-trnH序列能成功鉴别巴戟天及其3种近缘植物。     

叶籽银杏trnS-trnG序列测定与分析

利用叶绿体基因trnS-trnG基因间隔区的通用引物,扩增并分析了不同地区的14株叶籽银杏和2株银杏的trnS-trnG基因间隔区序列,结果表明,14株叶籽银杏和2株银杏的trnS-trnG序列长度均为1005bp,A+T的含量为62.19%—62.39%。各样品之间变异小,14株叶籽银杏和2株银杏共有23个可变位点,1个信息位点,这些变异都以碱基的置换发生。除这些变异位点外的核苷酸序列完全相同,说明各样品序列之间具有高度同源性。YZ1变异位点较多,与其它样品的同源性较低。所测序列Blast检验后发现叶籽银杏trnS-trnG序列与银杏的相似度最高,苏铁类次之。用DNASTAR软件对14株叶籽银杏和2株银杏的trnS-trnG基因间隔区序列进行同源性和差异性分析,建立了系统进化树。     

基于清风藤属植物DNA条形码的叶绿体序列筛选

基于叶绿体基因matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列分析9种清风藤属植物DNA条形码可行性。结果表明,清风藤属3条叶绿体基因中,matK序列最长(805 bp);psbA-trnH序列的GC含量最低(29.7%),变异位点数(46)与简约信息位点数(32)最多。种间变异顺序为:psbA-trnHmatKpsbK-psbI;种内变异顺序为:psbA-trnHpsbK-psbImatK。遗传距离分析、barcoding gap分析与Wilcoxon秩和检验分析结果显示,在9种清风藤属植物中,只有psbA-trnH序列种内最大变异小于种间最小变异,matK序列种间差异较大。从系统进化树分析结果看,3条序列均可以区分部分物种,matK序列鉴定效率较高。因此,3条序列均不适合单独作为该属植物的DNA条形码。在后续的研究中,建议以matK作为DNA条形码辅助序列与其它候选序列进行联合分析,以提高清风藤属DNA条形码鉴定效率。     

基于cpDNA序列的猕猴桃种质资源多态性分析

中国是猕猴桃属植物的分布中心,种质资源非常丰富。本研究以23份猕猴桃为材料,采用CATB法提取叶片DNA,经PCR扩增获得长为621 bp的trn T-trn L基因间隔序列和长为500 bp的trn L-trn F基因间隔序列,包含110个变异位点,79个简约信息位点,种间遗传距离为0~0.054。基于trn T-trn L基因和trn L-trn F基因序列,采用UPGMA聚类法、NJ邻接法、最小进化法和简约分析法分别进行了猕猴桃属植物的分子系统重建,结果表明可将所有的材料大致分为四类,其中净果组单聚为一类,作为单系类群,位于系统发育树的基部,这些遗传变异丰富的种质资源可为猕猴桃育种提供有价值的材料。     

栀子的psbA-trnH序列分析与鉴别

对栀子的psbA-trnH片段进行PCR扩展、测序,利用MEGA 6.0进行序列分析,计算样本的遗传距离(Pair-wisedistance法)和发育系统树(neighbor-joining法).结果表明,10种栀子属的psbA-trnH序列长度为250～297 bp,A+T平均含量74％,变异位点占24.76％;简约信息位点占6.43％.Pair-wise distance(PW)法计算遗传距离,平均遗传距离为0.058;邻接法(NJ)对栀子属种间的系统发育进行聚类分析,成功鉴别供试样本.psbA-trnH片段可作为栀子属物种分子鉴别的候选序列.     

基于叶绿体DNA trnL-F序列研究部分鸢尾属的亲缘关系

利用通用引物,采用PCR技术从24个鸢尾样品中扩增了叶绿体基因组trnL-F间隔区的DNA片段,进行了序列测定,序列长度为1 003～1 113 bp,比较长度为954 bp,其中共有92个位点发生了单个碱基的置换,14个位点发生了缺失,因此有进化意义的位点共106个,约占总序列比较长度的11.11%.运用DNAMAN软件分析了这些鸢尾的亲缘关系,可分为2个相对独立的大组.第一大组可以分为2组:3个种源马蔺关系很近形成一组,粗根鸢尾、溪荪和喜盐鸢尾聚成一组.第二大组也分为2组:6个种源的马蔺与野鸢尾聚在一起,再和小鸢尾聚成一组;3个种源的鸢尾、高原鸢尾、德国鸢尾、矮鸢尾、野鸢尾、扇形鸢尾、红籽鸢尾和I.ungiucularis聚成一组.     

辣椒细胞质雄性不育基因的AFLP分析

本文采用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术对辣椒(Capsicum annuum L.)细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物PstⅠ-NNN+Mse Ⅰ-NNN组合,有60对引物组合均在两系间扩增出5 447条带,多态性位点为4个,其中在不育系材料中仅有2个多态性片段AGC/CGC378和ATC/GAG446,对特异片段进行克隆、测序,其序列全长分别为340 bp和408 bp,它们编码的氨基酸序列与烟草基因组线粒体DNA序列同源性达94%和96%.     

SDS-蛋白酶法分离棉花cpDNA及psbA基因启动子、终止子克隆

采用SDS-蛋白酶法提取了棉花的叶绿体DNA.琼脂糖电泳及紫外分光光度分析表明,所提取的叶绿体DNA质量高.用所提取的叶绿体DNA作为模板进行RAPD扩增,获得了清晰的扩增图谱.同时以所提取的叶绿体DNA作为模板,以psbA基因启动子、终止子序列设计引物,成功地扩增出预期为312 bp和382 bp的目标片段.将目标片段克隆测序,经Blantn分析,结果表明上述片段正是psbA基因启动子、终止子序列.该方法与传统的提取方法相比省时、高效、无污染,为进一步开展棉花叶绿体基因工程奠定了良好基础.     

玉米Rubisco活化酶基因ZmRCA1的序列变异分析

Rubisco活化酶(RCA)是一种可激活光合作用关键酶Rubisco的伴侣蛋白,可通过对Rubisco的活性调节决定植物的碳同化效率。为了研究玉米ZmRCA1的多态性,本研究参考GenBank中编码玉米Rubisco活化酶的ZmRCA1基因组序列设计引物对玉米微核心种质的95份自交系的ZmRCA1进行测序,获得长约1 680 bp的基因组序列。多态分析表明,在1 680 bp的区间内共发现22个SNP和8个InDel,其中5个SNP和1个InDel变异产生氨基酸序列改变;频率在0.1以上的13个多态性位点共形成27种单倍型,利用6个多态性位点就可以分辨约90%的单倍型。ZmRCA1基因具有高度序列保守性,基因DNA序列相似性为97.9%,而氨基酸序列的相似性则达99.8%;中性检验表明ZmRCA1基因符合中性进化模型假设,没有发生纯化选择。     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

百合属ISSR反应条件优化的研究

建立一个稳定性高、重现性好,适合百合ISSR遗传差异分析的PCR反应体系。设定反应体系中各因子的不同浓度并进行PCR扩增,依据稳定性高、重现性好的原则,对该反应体系进行调整与优化,最终建立稳定可靠的ISSR反应体系。适于百合ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为：40 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg²⁺,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.8μmol/L引物,200μmol/L dNTPs;扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,51.8℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35个循环;最后72℃延伸8 min。所建立的百合ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、检测多态性能力强等特点,为应用ISSR标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了技术基础。     

芝麻SSR检测体系的优化与应用

为了建立一套适用于芝麻SSR标记检测的技术体系,以5个芝麻新品种为试验材料,选用35对SSR引物,从反应体系、反应程序、电泳、银染4个环节进行优化。结果表明：反应总体积为10 μL,优化后的基本成分及用量分别为25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL,10 mmol/L dNTPs 0.3 μL,5 U/μL Taq酶0.3 μL,50 ng/μL Primer 0.9 μL,10×Buffer 0.7 μL,25 ng/μL DNA模板2.5 μL,ddH2O 4.1 μL。反应程序为：94℃ 3 min;94℃ 1 min,60℃ 30 s,72℃ 45 s,10个循环;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 45 s,30个循环;72℃ 5 min。PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银快速染色检测效果良好。筛选出多态性较强的SSR引物24对,用这些引物对20个品种进行扩增,初步分析了SSR标记应用于芝麻DNA指纹分析的潜力。     

绣球属植物SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定绣球属植物SRAP-PCR最适宜的反应体系,以19种绣球属植物为材料,利用单因素分析法对影响SRAP-PCR反应体系的5个因素（DNA模板量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,Taq聚合酶量和引物浓度）在11个水平上进行优化试验。结果表明,最佳的25 μL反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL,DNA模板量30 ng,Mg2+浓度1.6 mmol/L、dNTPs浓度0.6 mmol/L,Taq聚合酶量3.5 U,引物浓度为0.2 μmol/L。单因素分析法获得的最佳反应体系适合绣球属植物SRAP的遗传多样性研究。     

砂仁及其混伪品益智仁的ISSR分子鉴别

为创建砂仁及其主要混伪品益智仁的ISSR分子鉴别方法,以UBC818为引物,对影响ISSR-PCR反应体系的引物、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶和Mg2+浓度进行5因素4水平正交优化试验,并在此基础上筛选阳春砂ISSR引物及砂仁正伪品的鉴别引物。结果表明,20μL阳春砂ISSR-PCR最佳反应体系包括引物0.5μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、DNA模板40 ng、Taq DNA聚合酶1.2 U、Mg^2+2.0 mmol/L;从52条ISSR引物中筛选出10条阳春砂ISSR引物,从6条阳春砂和益智的共同引物中,筛选出扩增条带清晰、多态性强的砂仁正伪品的鉴别引物UBC808,利用UBC808对15份样品进行验证试验,结果表明鉴别体系稳定性好,可用于砂仁与益智仁的快速、准确鉴别。     

砂梨的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以砂梨基因组为材料,通过单因素试脸,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合砂梨的ISSR-PCR反应体系和应用程序为为: 20 μl PCR体系中,1 x Taq 酶配套缓冲液,0.5 U Taq DNA 聚合酶,0.7μmol / L引物,100μmol / L dNTPs,2.25 mmol/LMgCl2,40ng模板DNA。最佳扩增程序为：预变性：94°C 5min; 94°C变性45sec,52°C退火45sec,72°C延伸1min;共40个循环后,最后72°C延伸10min,4°C保存。用引物836可以将这16份砂梨材料区分开。砂梨ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行砂梨品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析莫定了良好基础。     

蓖麻标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系的建立

为了建立Lm型雌性系蓖麻不同发育时期的标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系,提取不同类型不同发育时期的花序基因组DNA,混合成基因池;用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的组合,12 h可将DNA酶切完全;16℃条件下,将酶切产物与EcoRⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接头过夜连接;连接产物用于预扩增。优化后的预扩增反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs(10 mmol/L)2.5μL、Mg2+(25 mmol/L)2.0μL、模板2.0μL、E0扩增引物(10pmol/μL)1.5μL、H0扩增引物(10 pmol/μL)1.5μL、LA Taq(5 U/μL)0.25μL、dd H2O 12.75μL。预扩增产物稀释10倍后用于选择性扩增。优化后的选择性扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs(10 mmol/L)2.0μL、Mg2+(25mmol/L)4.0μL、模板3.0μL、EX扩增引物(10 pmol/μL)1.0μL、H/MX扩增引物(10 pmol/μL)1.0μL、LA Taq(5U/μL)0.30μL、dd H2O 11.2μL。     

茶树TRAP反应体系的建立及正交设计优化

TRAP标记技术因操作简单、重复性好、效率高等特点得到广泛应用,但该技术在茶树中的研究报道较少,且茶树TRAP-PCR体系优化尚未见报道。笔者采用正交设计的方法,对茶树TRAP-PCR反应中Mg2+、Taq酶、dNTP、固定引物、随机引物5个因素进行了优化研究,建立了茶树TRAP-PCR最佳反应体系。该20 μL反应体系含有2 μL 10×PCR Buffer (Mg2+ free),50 ng模板DNA,1.75 mmo/L Mg2+,0.50 U Taq酶,0.20 mmol/L dNTP,0.20 mmol/L随机引物和0.20 mmol/L固定引物。根据优化结果,利用最佳反应体系,选用16个茶树品种对TRAP标记多态性进行了初步研究。     

大白菜单拷贝序列的长片段PCR体系优化

目的序列长片段PCR产物可作为FISH技术的有效探针进行分子细胞遗传学研究。然而,传统PCR技术对于5 kb以上的长片段进行有效扩增很难。合适的反应条件及反应体系是进行长片段PCR有效扩增的必要前提。为了获得目的序列长片段PCR产物以用于FISH研究,根据大白菜A03染色体顶端无重复序列区段设计了80对长片段PCR引物,从基因组DNA模板质量、d NTPs浓度以及退火温度和延伸时间方面对PCR技术体系进行了优化。试验证明,选用幼苗嫩叶的基因组DNA和LA Taq DNA聚合酶可以提高长片段PCR引物的扩增质量和扩增效率;确定了适合5~15 kb长片段PCR的反应体系为20μL:50 ng/μL模板DNA 2μL,2.5 mmol/L d NTPs 1.6μL,10μmol/μL正反引物各1μL,10×LA PCR BufferⅡ(含Mg2+)2μL,5 U/μL LA Taq酶0.2μL;反应条件为98℃变性15 s;58~64℃退火10 s,68℃延伸5 min,35个循环;68℃延伸10 min,4℃保存。在大白菜基因组中成功获得了60对5~15 kb的扩增片段。为在大白菜粗线期染色体上开展长片段PCR-FISH技术研究及在近缘种间开展比较染色体涂染揭示进化关系奠定了理论基础。