丹参钙调蛋白cDNA的克隆及其反义表达载体的构建

丹参是著名的传统中药,对心血管疾病和癌症有广泛的疗效。钙调蛋白是细胞信号转导途径中的重要蛋白,在各种生理活动中起着重要的作用,其序列比较保守。国内外对中药丹参的分子学研究很少,本文利用分子生物学手段克隆了丹参钙调蛋白基因。从丹参成熟叶片中提取总RNA,cDNA第一链经反转录合成,利用设计的引物,PCR扩增,得到丹参钙调蛋白基因,测定其全序列。在GeneBank进行了注册。其次构建了丹参钙调蛋白基因反义表达载体,以后可进行基因敲除。通过Southern杂交,进行拷贝数推测,丹参钙调蛋白cDNA至少为2个拷贝。序列分析结果表明:得到的丹参钙调蛋白基因具有完整地读码框,由454个核苷酸组成,编码150个氨基酸。与别的植物钙调蛋白基因相比有很高的同源性,核苷酸序列同源性在80%以上,编码的氨基酸序列同源性在80%以上。以上结果能使我们更加深入地研究和了解钙调蛋白。     

甘蔗ADP/ATP转运蛋白酶基因克隆及其序列的生物信息学分析

摘要：【研究目的】甘蔗(Saccharum officinarum Linn) 是C4光合途径作物,有着特殊的能量代谢系统,研究其能量代谢过程的ADP/ATP转运蛋白酶基因具有重要的意义。【方法】本研究采用同源克隆原理和PCR技术克隆甘蔗AAC转运蛋白酶基因,并应用生物信息学方法,对其进行多序列比对分析、物理性质分析、三级结构预测、亚细胞定位、跨膜区域预测和疏水性分析。【结果】克隆获得甘蔗AAC cDNA序列全长为1170bp,包括一个可编码387氨基酸的完整ORF。生物信息学分析显示,AAC家族基因的N端序列相对不保守,C端序列高度保守;其的分子量是42.265 kD,理论等电点是9.79,预测其为稳定的蛋白;GRAVY值为-0.099;含有6个跨膜区域;其6个跨膜螺旋(TM1-TM6)跨越磷脂双分子层结构,盐桥可能是通过中间的3个连接螺旋α1-α3共同构成的;定位在细胞质的概率为60.9%。【结论】本研究获得甘蔗AAC 完整ORF序列,并通过生物信息学预测该基因所编码的蛋白为一个稳定跨膜蛋白,其可能定位在细胞质。这些研究为甘蔗AAC基因的深入研究和应用奠定初步基础。     

粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶基因克隆及表达分析

粟弯孢霉叶斑病为谷子重要的叶部病害，为了解钙调磷酸酶信号途径在粟弯孢霉叶斑病菌中的功能，对粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶基因进行了克隆和初步分析。通过简并PCR法扩增获得了粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶催化亚基ClCna和调节亚基ClCnb基因的同源片段，并利用RACE技术获得了ClCna和ClCnb基因序列同源片段的全长cDNA序列。粟弯孢霉叶斑病菌ClCna和ClCnb基因编码的蛋白与其他病原真菌钙调磷酸酶蛋白具有很高的同源性，ClCna基因编码的蛋白含有钙调素结合位点、钙调磷酸酶调节亚基结合位点和自身抑制调节位点，而ClCnb基因编码的蛋白含有4个钙离子结合位点。利用钙调磷酸酶特异性抑制剂环孢素A处理粟弯孢霉叶斑病菌分生孢子，发现分生孢子的萌发率明显下降。利用实时荧光定量PCR方法分析粟弯孢霉叶斑病菌中ClCna和ClCnb基因在非生物胁迫下的表达模式，在山梨醇和氯化钠胁迫下都是诱导表达，因此，推测这2个基因可能在粟弯孢霉叶斑病菌的逆境胁迫及孢子萌发中起重要的作用。     

棉花叶绿体70S核糖体S7蛋白基因的克隆和序列分析

叶绿体基因组具有高度保守性，来源于不同植物的叶绿体基因同源性很高。应用ＰＣＲ技术，从棉花叶绿体基因组扩增并克隆了长度为１．０ｋｂ的叶绿体ＤＮＡ片段。该片段含有叶绿体核本小亚基Ｓ７蛋白基因ｒｐｓ７。采用限制性内切酶消化连接的策略构建亚克隆，并测定了该片段的含部核苷酸序列。结果表明，棉花叶绿体ｒｐａｓ７基因与烟草、不稻的相庆基因同源性高，分别为９７．９％和８９．５％，３非编码区的同源性分别为９６．３％     

甘蔗谷胱甘肽硫转移酶基因SoGST-1a的克隆与表达分析

克隆甘蔗谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因,并分析其序列特征和表达谱,为甘蔗抗旱育种提供基因来源。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术从甘蔗品种‘新台糖22号’中克隆到一个甘蔗GST基因,命名为SoGST-1a。通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测其表达谱。序列分析表明该基因cDNA全长702 bp,编码224个氨基酸,预测的蛋白分子式为C₁₁₁₇H₁₇₅₀N₃₀₀O₃₂₈S₆,蛋白分子量为24.82 kDa,等电点为5.96。蛋白疏水性分析推测其为亲水性蛋白。保守结构域预测表明SoGST-1a蛋白具有2个GST结构域。系统进化树分析表明该基因与玉米Zeta类GST蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,干旱胁迫下SoGST-1a基因下调表达。研究结果表明,SoGST-1a基因可能在甘蔗干旱胁迫中并不发挥一定作用。这些结果为深入了解SoGST-1a基因的生物学功能奠定了基础。     

甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScD27的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新型植物激素,D27基因是独脚金内酯生物合成途径中最上游的调控基因,且该基因调控SLs的合成是一个可逆的过程。本研究根据水稻、玉米、高粱、二穗短柄草4种禾本科作物的D27基因核苷酸序列保守区域设计引物,以甘蔗品种ROC22的c DNA为模板,利用RT-PCR和RACE技术,从甘蔗中克隆出D27基因的c DNA全长序列,命名为Sc D27,Gen Bank登录号为KP987221.1。该基因序列全长1379 bp,包含一个867 bp的完整开放阅读框(ORF),编码288个氨基酸残基。Sc D27编码的蛋白质分子量为71.58 k D,理论等电点为5.04,是一种非分泌性蛋白,主要分布于叶绿体上,该蛋白的保守区可能具有2个锌指蛋白结构域(Zn F_TAZ和Zn F_A20),且不存在信号肽;该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与高粱、谷子、大麦、短穗二柄草等禾本科植物的D27氨基酸序列相似性在70%以上;Sc D27基因在甘蔗各组织部位均有表达,其中茎尖和腋芽中表达量较高,叶、茎和根中的表达较低。此外,Sc D27基因在甘蔗茎尖中的表达受PEG、盐胁迫、磷缺乏和营养缺乏的诱导,推测Sc D27基因是甘蔗独脚金内酯生物合成途径中响应非生物胁迫的关键基因。     

苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。     

蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建

为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式，在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料，克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析，包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示，RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸，含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明，RcCML42与巴西橡胶树一致性最高，达86.84%。qRT-PCR结果显示，RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达，在经NaCl处理后，RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达，在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器，通过与钙调素结合蛋白结合...     

小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

甘蔗和斑茅Ⅲ型过氧化物酶基因（SoPOD-1和SaPOD-1）cDNA克隆与分析

研究旨在通过克隆甘蔗和斑茅Ⅲ型过氧化物酶基因(Prxs),分析比较2个物种Prxs基因差异,探讨2个物种Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,以高粱Prxs基因序列为探针,克隆获得甘蔗和斑茅Prxs基因。本研究从斑茅和甘蔗中成功克隆获得了4个Prxs基因cDNA序列,其中斑茅2个基因长度均为1083 bp,存在一个差异位点,甘蔗2个基因长度均为1084 bp,存在11个碱基差异。4个基因开放阅读框均为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,克隆获得的4个基因均具有Prxs典型保守结构域,为目标基因。系统进化分析表明,克隆获得的基因与高粱、玉米和水稻的同源基因相似性最高,在一些双子叶植物,甚至裸子植物也能找到其同源基因,且氨基酸序列的相似程度与物种分化的程度基本一致,可供植物分类作参考。该试验从斑茅和甘蔗中成功克隆获得了4个Prxs基因cDNA序列,为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考。     

甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列, 其中5条来自基因组DNA(EF059973, EF059974, EF059975, EF059976和EF059977), 6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a 和疏水结构域。聚类分析表明, 11条RGA同RPS2和XA1聚为一类, 而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中, kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明, 编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响, 而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。     

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。     

福州地区甘蔗黄叶病病原分子鉴定及电镜检测

电镜观察表明，感病甘蔗叶片的韧皮部伴胞内存在着大量类似甘蔗黄叶病毒（SCYLV）的病毒粒子；利用RT-PCR扩增出556 bp的目的片段，氨基酸和核苷酸序列分析表明，该片段是SCYLV外壳蛋白基因的一部分，与其他国家SCYLV分离物同源性达95%以上；应用组织印迹杂交免疫检测技术，在YLS病症的叶片中脉韧皮部出现紫红色斑块，呈阳性反应。综合分析认为福州地区甘蔗黄叶病的病原体为SCYLV。     

甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因(SPS3-1)的克隆与序列分析

以甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(SPSⅢ-2,NCB1登录号为EU278617) cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证分离了甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因组DNA序列(SPS3-1,GeneBank登录号为FJ750250).该序列全长6 325 by,包含13个...     

自交亲和苹果品种S基因型的鉴定

为了探讨苹果自交亲和的发生机理,根据保守氨基酸序列"FTQQYQ"和"anti-1/WⅠPNV"设计了苹果花柱S基因的通用引物:P1:5＇-TTTACGCAGCAATATCAG-3＇;P2:5＇-ACGTTCGGCCAAATA/CATT-3＇,根据 GeneBank登陆的花粉SLF1(DQ422810)、SLF9(AB270792)基因设计了花粉S基因的引物分别为:P SLF1(上游5＇-3＇:CTGGTGGTGTTCTTTCCTGTGTAT;下游5＇-3＇:ACTTAACTCTTCCCTCAACTCA)和P SLF9(上游5＇-3＇CAGGTGCGTGAAAGTGAAA;下游5＇-3＇:TGAGCCAAGCATAAGAACCT),以自交亲和的苹果品种早红香为试验材料,利用PCR-RFLP、克隆、测序等方法研究早红香苹果发生自交亲和的分子性状.结果表明:自交亲和的早红香苹果2条花柱S基因没有发生变异.经BLAST比较,由花粉S基因引物P SLF1 和P SLF9扩增得到的花粉S基因的DNA序列,与MdSLF2 和MdSLF9 基因DNA序列的相似性分别为94%和96%,推导氨基酸序列相似性分别为94%和97%.由P SLF1扩增得到的花粉S基因SLF1?与MdSLF1的DNA序列相似性仅为83%,且二者不一致的碱基分布于整个DNA序列中,自交亲和苹果品种早红香花粉SLF1?基因可能变异为了MdSLF2.     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

广西蔗区检测发现检疫性病害甘蔗白条病

为明确2016年在广西北海、来宾、百色蔗区发现的疑似甘蔗白条病症状蔗株致病病原。利用白条黄单胞菌特异性引物XAF1/XAR1对采自这3个蔗区的62份疑似病样进行PCR检测鉴定。鉴定结果表明：62份疑似病样都能够获得约600 bp的特异性片段,所得序列完全一致大小均为608 bp（GenBank登录号：KY315183--KY315203),其与白条黄单胞菌raxB1基因核苷酸序列（GenBank 登录号：FP565176）一致性为100%,在系统进化树中处于同一分支。田间调查结果显示：甘蔗品种‘桂糖46号’、‘桂糖06-2081’对于白条黄单胞菌高度感病,病株率一般为18%~50%,严重田块高达100%;染病严重蔗株全叶枯萎,茎的节部长出许多侧芽,侧芽叶片具白色条纹,造成大幅度减产减糖。本研究在广西蔗区检测发现由白条黄单孢菌引起的检疫性病害甘蔗白条病。     

梅花PmCBF基因的克隆及表达

CBF转录因子在植物冷驯化中起着重要调控作用。以欧洲甜樱桃CBF基因为信息探针,从李属基因组数据库中得到一个候选序列,设计特异引物,通过PCR扩增和RT-PCR验证,发现与预测序列一致。该基因全长711bp,可编码225个氨基酸,序列分析发现其具有CBF基因的特征序列,包含保守的AP2/EREB DNA结合域以及CBF特征短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。同源性分析显示,PmCBF和欧洲甜樱桃、矮扁桃CBF基因一致性较高,均在90%以上,与欧洲甜樱桃的氨基酸同源性达100%。实时荧光定量PCR分析发现:4℃低温胁迫下,PmCBF在转录水平的表达情况和其他植物CBF基因一致;4℃处理后PmCBF基因的表达开始上升,4 h时达最大,初步表明PmCBF在低温胁迫下上调表达。     

甘蔗线虫病抗性基因的PCR检测研究

以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的保守序列区域,分别设计了2条上游引物、2条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用PCR特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物。用抗根结线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约460 bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约690 bp大小的特异片段,进一步进行了PCR-Southern杂交,确认了该2条特异引物的真实性。