广西香稻Badh2基因两种功能标记的开发

水稻的香味是一种重要的食味品质性状,是水稻第8号染色体Badh2基因突变导致其功能缺失,引起芳香活性物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的积累从而产生香味。Badh2基因至少存在18个等位突变位点,利用等位突变位点辅助培育香稻被证明是一个有效手段。传统Sanger测序法和SSR分子标记PCR电泳分析进行位点检测效率较低。为了开发效率更高的检测方法,本研究利用了实时荧光PCR检测技术对广西地方常见的水稻突变荧光分子标记。对40份广西地方香稻的Badh2基因进行直接测序,发现这些香稻的Badh2基因主要存在两种突变,第4、5外显子806 bp缺失(badh2-E4-5.1)和第7外显子8 bp缺失(badh2-E7)。针对这两种突变类型设计实时荧光PCR检测方法,并对已测序的40份香稻进行验证,实时荧光PCR检测的准确性达到93.75%。进一步对50份地方品种进行香味基因型分型鉴定,其中24份香稻为badh2-E4-5,22份香稻为badh2-E7。本研究针对广西地方香稻品种的主要两种突变类型,设计开发了这两种等位基因的荧光分子标记,适用于香稻基因型的鉴定筛选,对香稻育种具有重要的现实意义。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

‘泰国小香占’香味基因的鉴定和功能分子标记的开发

香稻育种已成为当前杂交水稻育种的一个重要方向,选择和利用株型好、米质优、抗性强等综合性状优良且具有香味的水稻亲本,尤其是香型水稻恢复系亲本的利用,对进一步促进杂交水稻香稻的选育具有重要意义。‘泰国小香占’是目前国内水稻香稻育种中应用较广且综合性状优良的恢复系亲本,其米质优、抗性强、香味浓。为了探究‘泰国小香占’香味产生的原因,本研究鉴定了‘泰国小香占’的香味基因及其突变类型,发现其香味来源于编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2的功能缺失突变,且通过对该基因完整基因组序列扩增和测序分析发现其等位突变类型为badh2-E7类型,即在第7外显子处存在8 bp缺失和3个单核苷酸位点多态性突变(SNPs)。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定其籽粒中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量为0.108 mg/kg,明显高于非香味品种‘日本晴’和‘9311’的含量(0.01 mg/kg)。实验还证明了特异性分子标记FMbadh2-E7、InDel-E7以及自主开发设计的特异性功能标记FMbadh2-E7A和FMbadh2-E7B均可高效、准确鉴别出非香纯合(Badh2/Badh2)、非香杂合(Badh2/badh2)和香味纯合(badh2/badh2) 3种基因型。同时本研究还进一步通过对‘泰国小香占’和非香味水稻品种杂交F2代单株进行了基因型和遗传规律分析,发现其基因型Badh2/Badh2:Badh2/badh2:badh2/badh2的比例为1∶2∶1,符合孟德尔细胞核单基因控制分离比。本研究通过对‘泰国小香占’香味基因的鉴定、遗传特性分析以及特异性功能分子标记的开发和验证,为进一步通过分子标记辅助选择育种技术,应用‘泰国小香占’香味基因培育优质、高产且抗性强的杂交水稻香稻提供了重要的理论基础。     

水稻种质资源香味基因Badh2的分子鉴定及香稻筛选

稻米香味性状是稻米品质的重要评价指标,香稻的培育是提高稻米附加值进而提高农民种粮积极性的有效手段,而香稻育种面临遗传背景来源单一的瓶颈大大制约了香稻的育种进程。发掘和利用香稻种质资源,扩大香稻遗传多样性是解决这一问题的主要途径。本研究利用已知水稻香味基因Badh2的分子标记,分析了来自世界各地的817份水稻种质资源及25份野生稻祖先的Badh2基因型。通过品尝法对具有突变型Badh2的稻米进行了香味性状鉴定,研究结果表明,83份水稻种质资源材料具有突变型Badh2基因,其中包括籼稻52份、粳稻30份、中间型1份;而普通野生稻和尼瓦拉野生稻均为野生型Badh2,表明香味性状是在栽培稻驯化过程中由香味基因Badh2自然突变产生。通过人工咀嚼法对83份具有突变型Badh2的稻米进行了香味性状鉴定,结果表明有28份稻米具有明显的香味,其中籼稻为20份,粳稻7份,中间型1份,并且籼稻香味浓郁程度普遍高于粳稻,推测Badh2受遗传背景影响而导致2-乙酰-1-吡咯啉在籽粒中积累量不同。本研究鉴定的香稻种质资源将为开展稻米香味性状遗传改良提供重要材料支撑。     

新型香稻渝恢2103香味分子遗传特性分析

香味是优良稻米品质的重要衡量标准之一,2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)是最主要的香味物质,然而2AP生物合成机理至今仍未确凿。本研究筛选了与2AP生物合成密切相关的甜菜碱脱氢酶2基因(Badh2)在30份水稻材料中的3种突变类型,从中发现1份新的香稻材料渝恢2103,该材料Badh2基因序列编码区无突变,遗传分析显示渝恢2103与badh2-E7突变型香稻宜香1B香味基因不等位,与非香稻杂交F2香与非香分离比接近9∶7,与香稻杂交F2香与非香分离比接近7∶9,表明渝恢2103的香味受多基因控制。进一步利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)比较了与2AP生物合成相关基因在日本晴、渝恢2103和宜香1B的表达情况,结果显示,Badh2基因在日本晴和渝恢2103中表达差异不大,但在宜香1B中表达量异常高;多数脯氨酸与谷氨酸代谢途径相关基因在宜香1B中的表达水平显著高于日本晴和渝恢2103;推测宜香1B的2AP合成同时受Badh2基因以及脯氨酸与谷氨酸代谢途径相关基因的影响;渝恢2103香味形成可能与这些基因无必然联系。渝恢2103特殊的遗传特性可能为水稻香味形成机理研究提供新的突破点。     

7份贵州禾香味鉴定及OsBADH2基因CDS差异分析

水稻OsBADH2基因功能丧失是稻米产生香味的内因。本研究对7份贵州禾和2份对照品种的香味性状进行物化鉴定,发现榕禾与2个对照品种为香稻,其余6份贵州禾都为非香稻。为解析贵州禾产生香味与OsBADH2基因的内在关系,通过TA克隆、测序分析和序列拼接,本研究获得9份材料OsBADH2基因CDS的序列信息,采用Megalign软件对其进行序列比对分析。结果表明:4份贵州禾(白香禾2号、半坡禾、黎平禾1号和黎平禾2号)的OsBADH2基因CDS无突变;榕禾和2个对照品种的CDS差异都为第7外显子的8 bp缺失和3 SNP;还发现2种新的CDS差异(白香禾1号为1 bp缺失和1 SNP,便禾为2 bp缺失和2 SNP)。这些结果为贵州禾香味品种保护及育种改良提供理论基础。     

两种筛选水稻badh2-E2类型香味基因分子标记的建立

本研究根据香味基因(badh2-E2)与非香基因(Badh2)在第2外显子7个脱氧核苷酸序列缺失差异,建立了一个新的STS分子标记和检测方法;并根据badh2-E2与Badh2+310 bp位点脱氧核苷酸的差异性,建立一个新的CAPS(EheⅠ)分子标记和检测方法。结果显示:建立的STS分子标记与前人的报道相比扩增的条带更小,只有100 bp左右,能够更加清晰地鉴别出香与非香基因型之间的差异;而建立的CAPS(EheⅠ)分子标记,纯合非香稻可获得长度为292 bp和375 bp两条带,纯合香稻可获得长度为667 bp一条带,杂合F1植株可获得长度为292 bp、375 bp和667 bp3条带,对于不同基因型检测结果的判断效果更明显。采用本研究建立的方法能够提高水稻badh2-E2类型香味基因选择效率。     

不同香味等位基因粳稻的分子和香味特性研究

利用水稻甜菜碱醛脱氢酶Badh2基因的两个外显子缺失标记引物从60份优质常规粳稻中筛选到11份香稻材料,对其分子基础和香味特性进行分析。追踪香稻系谱,发现外显子7缺失的材料其香味可能与籼稻种质有关。进一步利用第8染色体上37对SSR引物分析11份材料遗传基础,结果有20对呈现多态且检测到64个等位基因变异,平均等位基因数目为3.2个。聚类分析发现苏香粳1号和苏香粳2号归为一类且与其他材料遗传距离较远;对两品种感官评价发现幼苗植株和米饭香味特性均表现突出。利用半定量RT-PCR检测幼苗植株香味基因的表达量,发现不同品种幼苗地上部表达各异,且根部有香味基因不同程度的表达。研究结果为了解粳稻品种的香味特性和香稻育种提供了一定依据。     

48份水稻骨干材料香味及Badh2变异类型的鉴定

为促进香稻育种,明确水稻重要种质资源中香味基因的存在情况,本研究将传统香味鉴定方法(KOH浸泡法)与分子标记技术相结合,对48份水稻骨干材料的香味及香味基因Badh2变异类型进行鉴定。结果表明,在48份供试材料中,利用KOH浸泡法检测到具有香味的材料有44份;利用香味基因Badh2的7种等位基因变异类型功能标记检测到含有香味的材料有43份,其中,有41份为纯合香型,2份为杂合型,等位基因Badh2-E2的变异类型有37份,等位基因Badh2-E7的变异类型有6份,未检测到等位基因Badh2-E4-5、Badh2-E12、Badh2-E13、Badh2-UTR和Badh2-Pro的变异类型。通过比较KOH浸泡法与分子标记技术,发现仅有1份材料检测结果不同,明水香稻(X23)用KOH浸泡法检测出具有香味,但本研究所用的Badh2的7种等位基因变异类型功能标记却未检测出含有香味,说明该材料可能属于Badh2其他已报道的或新的等位基因变异类型,也可能是含有新的香味基因。     

贵州省优质水稻‘大粒香’香味基因分子标记的开发

‘大粒香’香味形成是由Badh2基因第7个外显子的8 bp缺失和3 bp突变引起。为了建立了‘大粒香’香味基因的快速准确的检测方法,本研究根据‘大粒香’和‘日本晴’Badh2基因序列的差异,设计了7条引物组合成11对功能标记检测引物,通过对引物组合扩增的产物进行电泳检测,筛选出最佳的引物组合。试验结果表明,开发设计的引物能够准确的检测出香味基因,PCR反应的最佳退火温度为60℃,其中BADH2-F1+BADH2-R+badh2-R2引物组合能准确区分非香基因纯合体、香味基因纯合体以及杂合体三种基因型。基于该功能引物引物组合BADH2-F1+BADH2-R+badh2-R2可以快速开展香味基因的MAS育种。本研究结果将有助于利用Badh2基因位点的分子标记培育香型优质水稻品种,为改良贵州省水稻品种的香味品质提供了技术支撑。     

利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质

有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。     

花香A香味基因的鉴定和表达分析

选择和培育综合性状优良、配合力好的香稻亲本,对提高杂交水稻香稻育种至关重要。花香A是四川省农业科学院生物技术核技术研究所通过航天育种技术培育而成的优良香稻不育系,其配制的组合米质优、香味浓。为了探究花香A香味产生的原因,本研究鉴定了花香A香味基因的类型,研究了遗传规律和表达模式等,发现其香味基因类型为Badh2-E7,香味基因Badh2在花香A中表达量较低,在花香A/川恢907的F2代不同纯合单株中表达水平存在明显差异;实验还证明了标记FMbadh2-E7可高效鉴别出不同基因型。本研究为通过分子标记辅助育种技术,应用花香A香味基因培育优质杂交香稻奠定了坚实的基础。花香A在杂交水稻育种中展现出更广阔的应用前景。     

不同来源水稻品种badh2基因的同源性分析

香味基因是香稻育种的关键。本研究采用香味基因Xiang7F/7R对来源于辽宁省农科院和牡丹江市场的9个水稻品种进行序列分析。结果表明:(1)9个水稻品种在近400 bp处均出现一条带。(2)序列同源性分析发现,稼禾1号和龙粳香1号出现8 bp的片段缺失和3 bp的碱基突变。(3)日本晴与NCBI上发布的日本晴在该基因位点上存在5个碱基的插入/缺失,同源相似性达到99%。(4)遗传距离和系统发育树均表明,稼禾1号和龙粳香1号的遗传距离为0,聚为同一分支。以上结果表明,香味基因对不同水稻品种具有较高的灵敏度,可用于香稻品种的筛选,进而为后续的香稻品种选育奠定基础。     

香型优质杂交稻‘渝香203’香味基因遗传分析

香味是水稻重要的品质性状之一。‘渝香203’是不育系‘宜香1A’与恢复系‘R2103’杂交而成的香型优质品种,具有香味浓、米质优、适口性好等特点。本研究通过‘渝香203’及其亲本香味的遗传分析发现,该品种的香味由2对不等位的隐性基因控制,且其商品粮的稻米香味比例高于普通香型杂交稻;Badh2基因的功能标记鉴定及该基因测序分析显示,‘宜香1A’的香味由其Badh2基因第7外显子的碱基变异引起的,而‘R2103’的香味不是Badh2基因控制的。因此‘R2103’是一个新香型种质资源,对其深入研究可为完善水稻香味遗传机制、高品质新材料创建与品种选育提供参考。     

利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系

稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T₀代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T₁代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T₂代植株表型性状、稻米蒸...     

利用基因编辑技术改良水稻直链淀粉含量与香味

直链淀粉含量是稻米品质的理化指标之一,理想的稻米直链淀粉含量是13%~18%,有香味的稻米特别受消费者欢迎。本研究利用CRISPR/Cas9系统对Wx、Badh2(fgr)2个基因进行定突变,分别在Wx的5’UTR内含子剪切点和编码区序列(CDS)的第13外显子处设计靶点,Badh2的编码区序列(CDS)的第3和第9外显子处设计靶点,构建2个双靶点CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化导入受体‘中早35’中,2个独立的转化事件分别得到14株和13株T0代转化苗,对T0突变情况分析表明,突变频率分别为57.1%,46.2%;对Wx基因编辑后产生的4个无转基因标记的T2代稳定株系进行直链淀粉含量测定,结果分别为12.2%、11.3%、7.4%、4.9%,比未编辑的对照‘中早35’(24.6%)大幅降低;同时对Badh2编辑后产生3个无转基因标记T2代稳定株系进行香气物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量测定,结果分别为228.16μg/kg,198.31μg/kg,2095.24μg/kg通过口嚼判断这3个株系确实有不同程度的香味,而没有香味的对照‘中早35’为0.000001μg/kg,以上所有株系的农艺性状与对照‘中早35’一致。综合结果表明,利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx、Badh2基因,获得了稳定遗传、较低直链淀粉含量且带有香味的突变体,为优质稻育种提供了新的种质资源和创建方法。     

利用基因编辑技术培育糯性水稻

为建立糯稻品种培育新体系,本试验研究了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Waxy(Wx)基因定向突变进而培育糯稻的效果。在Wx基因的第2、第7、第8、第10、第11和12外显子区域设计6个靶位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体,采用农杆菌介导法将基因编辑载体转入粳稻品种哈勃601,获得11~88株转基因再生植株。突变分析表明,转基因株突变率总体偏低(0%~30.77%),仅在第2、第7和第11外显子上发生突变,以1~2 bp的插入缺失为主,都为纯合或双等位突变。5份纯合T2突变体的稻米呈蜡质状,直链淀粉含量为由亲本的15.5%降至2.0%~2.6%,接近或达到糯稻水平,其RVA谱与糯稻对照相仿,淀粉粘滞性较亲本哈勃601显著下降。上述结果表明,通过利用CRISPR/Cas9可对Wx基因进行定向突变从而获得糯性材料,但在利用该技术培育新品种时,需要选择适当的靶位点并培育较多的突变体,才能从中选到符合国家标准的糯稻品种。本研究对利用基因编辑技术培育水稻新品种提供了科学依据。     

云南粳稻主栽品种的香味基因鉴定和不同检测方法的比较分析

本研究利用四引物等位基因扩增受阻突变体系PCR技术,结合KOH和咀嚼判定法,分析了86份云南粳稻主栽品种和2份对照粳稻品种的香味特性和香味基因的存在情况和基因型。研究结果表明:三种方法共检测到10个品种具有香味或携带香味基因(badh2),但三种方法的鉴定结果存在差异性。其中5个品种三种方法均能检测到香味并携带香味基因(badh2),2个品种用KOH法检测到香味但不携带香味基因(badh2),1个品种用KOH法检测到香味且携带香味基因(badh2),1个品种用咀嚼法检测到香味并携带香味基因(badh2),1个品种用KOH法和咀嚼法都未检测到香味但携带有香味基因(badh2)。PCR扩增DNA检测结果分析所有材料共出现3种香味基因型,即非香型Badh2/Badh2、杂合型Badh2/badh2和香型badh2/badh2。香味基因(badh2)在所分析云南粳稻主栽品种中出现的频率仅为8.1%,香味性状受badh2等位基因控制,且都为云粳系列的品种。研究发现将四引物等位基因扩增受阻突变体系PCR技术和咀嚼法相结合,可以提高香味性状的选择效率和准确性。     

甜玉米胚乳突变基因shrunken2的序列变异解析

Shrunken2基因编码葡萄糖焦磷酸化酶的大亚基,是玉米淀粉合成途径中的限速酶,shrunken2是Shrunken2的隐性突变等位基因,对甜玉米品质和风味的形成起着重要的作用。本研究以玉米B73的Shrunken2基因为参考序列,在58份甜玉米自交系中进行shrunken2基因的重测序,共获得了7 635 bp的核苷酸序列,涵盖了20个外显子,17个内含子以及3'UTR区域。基因多态性分析发现,在供试群体中共有多态性位点105个,包括78个SNP和27个Indel。与普通玉米B73的Shrunken2序列之间存在58个多态性位点差异,包括50个SNP和8个Indel,其中位于编码区的SNP位点包含2个同义突变和7个非同义突变。根据shrunken2基因全长序列和编码区序列可将该群体分成14种和4种单倍型。中性检测表明该基因经历了自然和人工双重选择过程。