作物叶片蛋白质组提取与酶切方法比较研究

蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液（pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、pH4.5醋酸盐）和TCA-丙酮处理对水稻、小麦、大豆和玉米叶片蛋白质提取的影响,同时以小麦叶片总蛋白和牛血清白蛋白为样本,比较了传统方法和微波辅助方法的酶切效率。结果表明,TCA-丙酮处理的小麦和水稻样品采用尿素/硫脲方法能获得较高的蛋白得率,而玉米和大豆样品采用尿素/硫脲直接提取时蛋白质得率更高,同时,微波辅助酶切值得用于蛋白质组样品制备。本研究采用适当的蛋白质提取和酶切方法,有效提高了蛋白质的提取率和鉴定率,可为进一步深入开展作物叶片的蛋白质组学研究提供借鉴。     

香蕉枯萎病菌双向电泳体系的建立及蛋白质组学初步研究

旨在对香蕉枯萎病菌胞内蛋白的提取方法进行优化,建立菌体胞内蛋白质双向电泳体系。在原有的基础上优化菌体胞内蛋白提取方法,提取蛋白质进行双向电泳,并应用质谱技术鉴定一些蛋白质来验证提取蛋白质的质谱兼容性。通过扩大培养的方法获得足够的生物量,采用过滤法收集菌体用来提取蛋白质,涡旋振荡30 min能有效破胞,提高蛋白质提取效率。甲醇和丙酮各清洗2次能有效的清除蛋白质中的杂质,得到了高质量的蛋白质图谱,选取了10个蛋白质点进行质谱鉴定,成功的鉴定了8个蛋白质点,代表了8种蛋白质。这些结果表明提取的蛋白质和采用的胶内酶解方法具有良好的质谱兼容性,能为进一步研究不同菌体之间的差异表达蛋白质提供技术支持。     

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。     

分级提取蛋白技术在蛋白质组学中的应用

以小鼠急性肝脏氧化损伤为模型,通过采用不同浓度的丙酮对小鼠肝脏蛋白进行分级提取和沉淀,用SDS-聚丙烯酰胺连续密度梯度凝胶电泳(SDS-PAGE)试验寻找差异表达蛋白质。通过试验发现,模型组中水溶性总蛋白、非水溶性总蛋白和膜蛋白总体表达量较空白组均有明显降低,进而对水溶性总蛋白进行的分级提取试验中发现有2个蛋白条带具有显著的差异性。进一步以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测差异蛋白的肽质量指纹,在蛋白质数据库中检索鉴定差异蛋白的种类,经鉴定两种差异蛋白分别为一种未命名蛋白和Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase),为进一步研究其损伤机理奠定基础。通过分级提取蛋白质样品的试验方法,降低了蛋白组学当中蛋白质分离的成本和技术难度,在保证蛋白纯度的同时提高了电泳的分辨率,电泳图中的条带清晰、分明,便于后期进行质谱分析,同时也为蛋白质组学的应用提供了一种新思路和新方法。     

菜籽饼粕中蛋白质的提取分离技术及应用研究进展

介绍了菜籽饼粕的脱毒以及从中提取蛋白质的各种方法,综述了菜籽蛋白在各个领域中的应用。重点阐述了水相酶解法和膜分离法在提取、分离菜籽蛋白中的应用。     

棉花根系总蛋白质提取及双向电泳方法的改良

对棉花根系蛋白的双向电泳提取技术进行改良,以获得更好的分离效果,为棉花根系蛋白质组学研究奠定基础。以鲁棉研28为材料,分别采用TCA/丙酮法、改良TCA/丙酮/SDS法、饱和酚-甲醇醋酸铵法这3种根系蛋白质提取方法,提取棉花幼苗根系总蛋白,并进行双向电泳进行蛋白质分离。在蛋白质含量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行比较。利用饱和酚-甲醇醋酸铵提取法提取的棉花根系蛋白,其蛋白样品纯度高,SDS-PAGE电泳图谱清晰,蛋白点数量最多为601个点;TCA/丙酮法提取得到的蛋白总量最高约为7.53 mg/g,但样品纯度低,SDSPAGE电泳图谱模糊,蛋白点数量最少为417个点。采用考马斯亮蓝染色,上样量为1 500μg获得的凝胶图谱效果较好。总之,适合棉花根系蛋白质提取的方法为饱和酚-甲醇醋酸铵法,在考马斯亮蓝染色蛋白质上样量为1 500μg时能获得优良的分离效果。     

感染新型鸭呼肠孤病毒的番鸭肝脏蛋白质组双向电泳方法的建立

为建立感染新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的番鸭肝脏蛋白质组双向电泳(2-DE)方法。本研究通过对人工感染NDRV的雏番鸭肝脏病变的观察,对肝脏蛋白质提取裂解液的配方、样品上样量、一向等电聚焦(IEF)参数等条件的对比和优化,建立了有效的番鸭肝脏2-DE方法。结果表明：采用攻毒后病变最典型的第5天的番鸭肝脏作为研究样品;采用研磨-超声-裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、40 mmol/L Tris-base、0.5% IPG buffer）法提取肝脏蛋白质,结合2D clean-up kit以及去拖尾DeStreak试剂纯化蛋白,按1100 μg上样,设置IEF参数为：50 V 12 h、200 V 1.5 h、500 V 1 h、1000 V 1 h、8000 V 3 h、8000 V 60000 V h、500 V维持,采用胶体考马斯亮蓝染色,能获得分辨率高、重复性好的2-DE图谱。应用建立的2-DE方法和PDQest 8.0分析软件,发现26个与正常番鸭肝脏蛋白表达水平超过3倍的差异蛋白点。该方法的建立为进一步寻找NDRV感染宿主组织相关蛋白以及水禽呼肠孤病毒差异蛋白质组学研究提供了技术支持。     

巴西橡胶树幼叶和成熟叶比较蛋白质组学初步研究

为研究不同发育时期橡胶树叶片的功能代谢及揭示天然橡胶胶乳的合成调控机制,本研究以巴西橡胶树古铜期幼嫩叶片（幼叶）和稳定期完全成熟叶片（成熟叶）为实验材料,提取蛋白并进行双向电泳分离,结果发现幼叶与成熟叶相比,蛋白表达图谱差异显著,鉴定出的已知蛋白中多数参与了碳代谢及蛋白的翻译后修饰功能。本研究建立了成熟的巴西橡胶树叶片比较蛋白质组学研究的技术体系,获得了高分辨率的叶片蛋白双向电泳参考图谱,鉴定出来的腈裂解酶A链,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶和肌动蛋白等在幼叶和成熟叶片中的表达量不同,这些结果为进一步揭示天然橡胶合成调控机制提供了一定的技术支撑与实验数据,对天然橡胶合成机制的研究以及其它热带植物叶片的蛋白质组学研究具有一定的参考意义。     

利用等电点聚焦电泳分离的种子蛋白的印渍来鉴定品种

品种鉴定能确保种子生产者和购买者种子的纯度。传统的方法主要是依靠大田表现出的形态特征来鉴定品种纯度,这些特征的表现通常受环境和管理经验的影响,用这些特征来鉴定品种是不可靠的。随着大量新品种的涌现,并且这些新品种缺乏新的特征来鉴定,增加了人们对品种纯度测定新方法研究的兴趣。其中最有希望的方法之一便是种子蛋白质的电泳。本文研究了在非变性等电点聚焦电泳凝胶上分离种子蛋白来鉴定品种的新途径。将这些电泳分离出的种子蛋白吸咐在可移动的膜上,形成印渍,一次电泳可进行多个酶的染色分析。例如,应用本方法,一次电泳,大豆种子可以进行苹果酸酶、硫辛酰胺脱氢酶和脂酶的分析,燕麦可以进行酯酶、过氧化物和总蛋白的分析,对小麦而言,一次可以显示出76个样品中种子麦醇溶蛋白的特征。这个技术和现在的淀粉凝胶电泳系统相比具有比较经济,且可以保持聚丙烯酰胺凝胶清晰度好的特点。因为等电点聚焦凝胶是在分子电荷基础上分离蛋白质的,所以用这种技术来鉴定品种弥补了现行以分子大小和电荷密度来电泳分离蛋白鉴定品种上的不足。利用等电点聚焦电泳分离的种子蛋白的印渍来鉴定品种纯度是一种经济且有效的。     

超高压大豆蛋白酶解物体外消化产物的抗氧化活性研究

以大豆分离蛋白为研究对象,分析超高压(0.1、100、200、300 MPa)对大豆分离蛋白结构及其酶解4 h的产物在胃肠消化过程中的抗氧化活性.结果表明,经200 MPa处理的大豆分离蛋白结构变化较为明显,不同压力下的酶解产物随着消化的进行,消化液的还原能力、自由基清除能力及抑制脂质体氧化能力均有不同程度的提升.与其他处理组(0.1、100、300 MPa)相比,采用200 MPa处理的大豆蛋白酶解物在体外消化4 h时对DPPH自由基和羟自由基的清除率最大,分别为96.8％和58.6％,消化5 h时抑制脂质体氧化能力最强,消化10 h时的还原能力最高,为0.462,O2·和ABTS自由基清除率分别为79.7％和4.5％.综合分析得出,200 MPa诱导蛋白结构变化,进而提高其酶解物在胃肠消化过程中的抗氧化活性.该研究为大豆分离蛋白高压酶解物应用于具有抗氧化功能的食品开发提供了理论依据.