款冬花DNA提取及ISSR体系优化

摘 要：为了从分子水平对款冬种质资源进行鉴定和遗传多样性分析,分别采用SDS法、CTAB法、改良SDS法和改良CTAB法提取款冬叶片基因组DNA,比较不同方法的提取效果,并用改良CTAB法提取的DNA进行ISSR-PCR扩增体系摸索,建立优化的ISSR-PCR反应体系。结果显示：改良SDS法和改良CTAB法都可以提取出高质量的DNA,最优的ISSR-PCR反应条件为: 20μl反应体系中含DNA模板约20ng,Taq 酶1.0 U,Mg2+ 2.00 mmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.6 μmol/L,1×PCR缓冲液。     

葡萄柚基因组DNA提取方法的比较及ISSR-PCR体系的优化

对4种基因组DNA提取方法进行比较,得到一种效率较高的、且适用于葡萄柚ISSR-PCR的DNA提取方法。同时,采用正交设计对影响葡萄柚ISSR-PCR的因子进行优化。实验结果表明,改良的SDS法提取的基因组DNA最适宜进行葡萄柚的ISSR-PCR扩增。ISSR-PCR产物在2%琼脂糖凝胶上检测,发现PCR扩增的平均条带数为2.7条。葡萄柚的最优ISSR-PCR反应体系为：20 μL总体积中含有2×buffer(Mg2+),0.2 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L引物,0.3 U Taq DNA聚合酶,5 ng DNA模板。     

小桐子基因组DNA的提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为从小桐子嫩叶中提取高质量的基因组DNA.采用改良CTAB法提取的基因组DNA通过OD260/OD280比值测定,琼脂糖凝胶电泳和ISSR-PCR扩增检测,结果表明改良CTAB法提取的DNA纯度高.可作为ISSR分子标记的模板.同时,采用正交设计的方法,对影响小桐子ISSR-PCR反应体系中的4个因素(引物、Taq DNA Polymerase、10xBuffer(含Mg2 )、dNTPs)在3个水平上进行优化试验.建立了适合小桐子的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR最优反应体系,即20μl的反应体系中含有30ng模板DNA、0.2mmol/L dNTP、0.3 U Taq酶Polymerase、0.8μmol/L Primer、3.0hanoi/L10×Buffer(含Mg2 ).     

珍珠黄杨DNA的提取方法比较及ISSR反应体系的优化

为从珍珠黄杨幼叶中提取高质量的总DNA,比较了1%CTAB、2%CTAB、4%CTAB和1.5%SDS 4种DNA提取方法.结果表明:2%CTAB提取的DNA A260/A280值最好,ISSR-PCR扩增效果最佳,是有效提取珍珠黄杨基因组DNA的方法.并在此基础上,以(CT)8G为引物,采用单因素实验法,确立了适合珍珠黄杨的ISSR-PCR反应体系:在总体积20 μL的反应体系中,含30 ngDNA模板,2.0 mmol/LMg2 ,0.30μmol/L引物,0.20 mmol/L dNTPs,1 U Taq酶.     

苏丹草RAPD反应条件的优化与应用

为研究不同因素对苏丹草随机扩增多态性DNA（RAPD）反应体系的影响，建立并优化反应体系；再利用优化体系绘制了DNA指纹图谱以区分两个高丹草品种。提取苏丹草的基因组DNA，分别设置Mg2+浓度为1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L；退火温度为34℃、35℃、36℃、37℃、38℃；Taq酶含量为0.6U、0.8U、1.0U、1.2U、1.4U进行PCR扩增。结果表明：Mg2+2.0mmol/L，退火温度36度，Tap酶活性值1.2U是进行苏丹草RAPD分析的最优反应条件。利用最优反应条件绘制了皖草2号和皖草3号的DNA指纹图谱，在该图谱中有A、B两条特征带，可以区分皖草2号和皖草3号。     

辽东地区胡桃楸天然林ISSR分子标记体系的建立和优化

为建立胡桃楸天然林ISSR-PCR反应体系,本实验从DNA的提取到扩增进行了研究。通过对比CTAB和试剂盒两种方法,发现胡桃楸最佳DNA提取方法为试剂盒法。利用正交试验设计法确定了胡桃楸ISSR-PCR反应最佳体系,并对影响胡桃楸PCR反应的Taq酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度等因素进行了优化。最终获得胡桃揪ISSR-PCR反应的最优扩增程序为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,48.3℃复性30 s,72℃延伸1 min,28次循环,最后72℃终延伸5 min。优化胡桃楸ISSR-PCR的最佳反应体系为:Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U/20μL、Mg~(2+)浓度为1.75 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L、引物浓度为0.35μmol/L、DNA模板浓度为150 ng/20μL。该研究为以后利用ISSR分子标记技术研究胡桃楸的亲缘关系和遗传多样性提供高效的技术手段。     

菜豆ISSR-PCR体系的优化与验证

用试剂盒法提取菜豆(Phaseolus vulgarisL.)嫩叶的基因组DNA,并以此为模板对影响ISSR-PCR反应体系的Taq酶量、模板浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度5个因素进行了优化。结果表明总体积为25μL的菜豆ISSR-PCR反应最优体系为:45ng模板DNA,1UTaq酶,2mmol/LMg2+,0.6μmol/L引物和0.1mmol/LdNTP,在此基础上对循环次数进行优化,最终确定最佳循环次数为45次。利用该体系,选取引物823对8份材料进行扩增,验证了该体系的稳定性。本研究旨在建立菜豆ISSR反应的最优体系,为今后利用该分子标记技术进行有关菜豆种质及遗传方面的研究奠定技术基础。     

茭草ISSR-PCR体系的优化

为了建立适用于茭草的ISSR-PCR反应体系,以湿地植物茭草基因组DNA为研究对象,筛选引物为UBC818,采用正交试验设计方法,建立了茭草ISSR-PCR反应体系和扩增程序。结果表明,在 25 μL反应体系中含有1×PCR缓冲液、250 μmol/L dNTP、2.0 mmol/L MgCl₂、0.5 μmol/L引物、1.0 U Taq DNA聚合酶和100 ng模板DNA最适用于茭草ISSR-PCR扩增。适宜的扩增程序为94℃ 5 min;94℃ 1 min;56℃ 45 s;72℃ 90 s;35个循环;72℃ 10 min;4℃保存。     

砂珍棘豆ISSR-PCR反应条件优化研究

以砂珍棘豆(Oxytropis racemosa Turcz.)DNA为材料,应用分子标记技术,分析了DNA模板浓度、Mg2 浓度、引物浓度和dNTP浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响,经优化试验建立了砂珍棘豆ISSR-PCR反应体系.20 μL PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:20 ng DNA模板,1 U Taq酶,0.24 μmol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.15 mmol/L dNTPs.     

新疆贝母DNA提取及ISSR-PCR体系的建立与优化

目的:从新疆贝母干叶片中提取高质量的DNA,建立ISSR-PCR体系并进行优化。方法:通过改进的CTAB法提取基因组DNA;综合利用单因素实验和L9(34)正交实验2种方法,对镁离子、dNTP、模板DNA含量、TaqDNA聚合酶量、引物浓度等因素进行优化,并采用温度梯度筛选引物的退火温度。结果:新疆贝母20μL ISSR-PCR最适反应体系dNTP为0.3 mmol/L,Mg2+为2.0 mmol/L,模板浓度为40～100 ng/(20μL),引物为1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶为1.0 U/20μL,引物UBC 859的最适退火温度为50.7℃。结论:此提取方法得到的DNA纯度高,ISSR-PCR扩增效果显著,为新疆贝母种质资源鉴定、遗传多样性分析奠定研究基础。     

大蒜ISSR-PCR反应体系的正交优化建立

为探寻出更适宜大蒜的ISSR反应体系,以‘弥渡紫皮’大蒜为试材,对ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素（dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物浓度、模板DNA）在4个不同水平上进行正交设计L16(45)优化。结果表明,含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol Mg2+、0.15 mmol dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol引物、20 ng/μL模扳DNA的25 μL反应体系为大蒜的最佳反应体系。利用新建立的反应体系对20个不同大蒜品种进行扩增,具有极好的稳定性和重复性。     

梨属植物ISSR技术体系的建立与优化

本研究以雪花梨为材料,对ISSR反应体系中的模板用量、引物浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量等一些重要参数进行探索和优化,初步建立了稳定的具有广泛适用性的梨属植物ISSR技术的反应体系及扩增程序,即20 μL体系中含1×buffer (内含1.5 mmol? L-1 MgCl2)、模板DNA 40～60 ng、引物浓度为0.2 μmol?L-1、 dNTP 200 μmol?L-1、Taq DNA聚合酶 1U。扩增程序为：94℃ 5 min、退火60s、72℃延伸120 s,然后连续39个循环为94℃ 60s、退火温度(52℃左右)60s 、72℃延伸120s,完成最后一个循环后,在72℃继续延伸10 min,然后在4℃保温,最后通过1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物。     

甜瓜ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

为在最短时间内找到甜瓜ISSR-PCR反应四个主要因素的最优水平,确定甜瓜ISSR-PCR最优反应体系进行本研究。采用CTAB法提取甜瓜基因组DNA,获得完整性好且纯度较高的DNA样品。利用统计软件MINTAB创建4因素3水平的正交试验设计,PCR结果用MINITAB进行方差分析。结果显示引物浓度对PCR反应结果影响最大,Taq DNA聚合酶对PCR结果影响最小,并对各因素水平间进行因素内多重比较分析,最终建立最优化的反应体系（20 μL）：1×buffer,100 ng DNA模板,Taq DNA聚合酶1 U,引物0.4 mmol/L,dNTP为0.1 mmol/L。     

枇杷ISSR扩增反应体系的优化

采用正交设计对影响枇杷ISSR-PCR的模板DNA、dNTPs、Primer、Taq酶及Buffer(含Mg2+)进行优化。试验结果表明:20μL反应体系中,含模板DNA5ng、dNTPs0.25mmol/L、Primer0.25μmol/L、Taq酶0.5U和10×Buffer(含Mg2+)3μL。此外,从95条ISSR引物中筛选出11条具有丰富的多态性位点的引物,同时优化各引物退火温度。     

石斛属植物ISSR扩增体系的建立与优化

旨在建立并优化石斛属植物的ISSR-PCR反应体系。通过对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子模板DNA、dNTP、10×PCR Buffer、引物以及Taq DNA聚合酶分别进行单因素优化,最终建立一套适用于石斛属植物的扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的ISSR最佳反应体系。20μL反应体系的适宜浓度及用量分别为：模板DNA 10 ng/μL 3μL,dNTP 2.5 mmol/L 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物4μmol/L 3.5μL,TaqDNA聚合酶5 U 0.2μL。这一优化体系适用于石斛ISSR分析,为今后遗传多样性与亲缘关系分析、连锁图谱构建、QTL定位、基因定位与克隆等方面的研究提供了技术支撑。     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。     

长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、300 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.75 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。     

正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究(英文)

以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。