普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1的克隆及表达分析

钙调素蛋白(calmodulin,CaM)作为植物细胞内介导多种功能的Ca²⁺结合蛋白,在调节植物的生长发育和抗病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆CaM基因的cDNA序列。序列分析表明,cDNA片段长713 bp,命名为PvCaM1,具有一个453 bp的开放阅读框(ORF),GenBank登录号为JN418801,该基因编码150个氨基酸,预测蛋白质分子质量为17.16 kD。蛋白质结构分析表明,PvCaM1蛋白含有4个Ca²⁺结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示,PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近,分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明,PvCaM1基因受尖孢镰孢菌菜豆专化型FOP-DM01菌株诱导表达,接种病原菌96 h,抗病品种260205根中PvCaM1基因的表达量达到最高,而感病品种BRB-130达到最低,260205叶中PvCaM1基因的表达量均高于BRB-130,而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调,在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明PvCaM1基因可能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对FOP-DM01菌株的防御反应,推测菜豆PvCaM1基因与镰孢菌枯萎病的抗病性有一定关联。     

陆地棉钙依赖蛋白激酶GhCDPK28-A10参与抗黄萎病的功能分析

【目的】解析GhCDPK28-A10在棉花黄萎病反应中的作用机制，并为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得Gh CDPK28-A10基因同源序列，进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测在经大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)或H₂O₂处理的棉株中GhCDPK28-A10基因的表达量变化。通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术验证GhCDPK28-A10在棉花抗黄萎病中的作用。【结果】进化树和基因结构分析表明，陆地棉中GhCDPK28-A10的6个同源蛋白具有相似数量的基序和CDPK家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域；启动子区域的序列分析发现GhCDPK28-A10包含响应茉莉酸(jasmonic acid,J...     

应用荧光定量PCR 技术分析普通菜豆品种中尖镰孢菜豆专化型定殖量

尖镰孢菜豆专化型(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)引起的菜豆枯萎病是菜豆生产中最严重的维管束类病害之一, 防治该病害有效方法是利用抗病品种。因此, 一种能够从菜豆受侵染组织中准确鉴定并定量检测枯萎病原菌含量的方法将有助于筛选抗性品种, 应用于普通菜豆枯萎病抗病育种。本研究基于荧光定量PCR技术开发出一种能够对定殖于菜豆组织中的枯萎病原菌准确定量的新方法。该技术对根、茎组织中病原菌DNA的最低检测量为1 pg, 能在接种病原菌6 d后明显区分抗病性不同的品种, 可在菜豆植株表现出明显发病症状前准确鉴定不同品种抗性水平的差异。经验证参试的感病品种BRB-130和A0640-1根、茎组织中定殖的病原菌DNA量显著高于抗病品种260205和黑芸豆, 与表型鉴定的结果完全符合。利用荧光定量PCR技术能够在病原菌侵染早期快速、准确、高效定量菜豆组织中定殖的病原菌, 这对指导菜豆抗病育种和植物病害传播的研究都具有非常重要价值。     

响应辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY转录因子筛选及其信号通路分析

在辣椒基因组中全面鉴定WRKY转录因子并筛选出受辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY基因,并分析关键CaWRKY基因参与的信号通路。以CM334和NMCA10399为材料,基于辣椒基因组和RNA-seq数据,并在水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下通过qRT-PCR技术检测基因表达并分析。全基因组共鉴定出69个CaWRKY基因。接菌后12 h,抗、感材料中分别鉴定出7个和3个差异表达基因;接菌后36 h,分别有13个和22个差异表达基因,表明抗病材料能更快速应答。在筛选出的8个关键CaWRKY基因中,CaWRKY19和CaWRKY65受SA诱导上调表达;CaWRKY50受MeJA诱导上调表达;CaWRKY25受SA诱导上调表达同时受到MeJA抑制下调表达,而CaWRKY49同时受SA和MeJA抑制下调表达,推测CaWRKY19和CaWRKY65通过SA,CaWRKY50通过JA,而CaWRKY25和CaWRKY49则通过SA和JA信号途径参与辣椒抗疫病防御反应。     

水稻稻瘟病菌诱导表达启动子OsQ16p的克隆与功能分析

qRT-PCR分析表明,日本晴OsQ16基因受稻瘟病菌诱导表达。利用PCR技术从日本晴基因组中克隆了该基因编码区5′端上游1 229 bp的启动子序列,命名为OsQ16p。用其取代pBI121中gus基因上游的CaMV35S启动子,构建重组表达载体pBIQ16p,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株。GUS组织化学染色和qRT-PCR分析表明: (1) gus基因在抗性愈伤组织和阳性转基因植株中均能表达; (2)转基因植株在接种稻瘟病菌后12 h,GUS表达量是处理前的2.7倍; (3)抗病相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)喷施转基因植株叶面后12 h,GUS表达量分别为处理前的3.1倍和3.5倍。以上结果表明,OsQ16p启动子具有启动活性,并明显受稻瘟病菌、MeJA和SA诱导表达。     

毛竹(Phyllostachys edulis)PheGT8和PheGT16基因的克隆与表达分析

三螺旋转录因子在植物响应非生物胁迫过程中具有潜在的作用。本研究通过对毛竹(Phyllostachys edulis)中2个三螺旋转录因子基因进行生物信息学分析,并对其在不同胁迫条件下的表达水平进行研究,初步解析毛竹三螺旋转录因子基因的功能。本研究克隆得到2个毛竹三螺旋转录因子基因PheGT8和PheGT16,发现这两个基因在低温、干旱、盐胁迫以及脱落酸(abscisic acid,ABA)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理时,表达均呈现了不同程度的上调或下调,表明这两个基因参与了毛竹应对非生物胁迫的应答过程,具有潜在的调控作用。     

HarpinXoo诱发植物过敏反应和抗病性信号传导解析

植物使用不同的信号通路控制对不同类型病原物的抗性。由水杨酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)介导的信号传导被称为植物抗病防卫基本信号通路。它们之间及与其它信号通路之间通过某些通调因子的作用进行交叉对话，形成复杂的信号传导网络，可以使植物应对不同刺激、快速调动防卫反应。这些因子如何对不同的外源信号作出反应，     

杧果E2F/DP转录因子家族生物信息学分析

E2F/DP转录因子是真核生物中细胞周期进程的关键调节因子,与植物激素共同发挥着重要的调控作用。以杧果全基因组为供试参考基因组,用生物信息学软件预测E2F/DP转录因子家族基因成员,并分析其理化性质、保守结构域、保守基序、进化关系,结合实时荧光定量PCR测定杧果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae, Xcm)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides, Cg)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和水杨酸(salicylic acid, SA)处理下基因表达量。结果表明,杧果全基因组中有8个E2F/DP转录因子,命名为MiE2Fs。保守结构域预测发现MiE2F1～MiE2F5均含有E2F＿DD,MiE2F7和Mi E2F8同时包含两个E2F＿TDP保守结构域;二级结构预测发现E2F/DP家族蛋白质二级结构相似,无规则卷曲和α-螺旋是MiE2F1～MiE2F8蛋白二级结构主要元件,其次是延伸链和β-转角;保守基序预测发现杧果有1个高度保守的基序Motif1;基于杧果和...     

多种激素对喜树悬浮细胞中喜树碱合成关键酶基因的影响

喜树中抗肿瘤活性成分喜树碱的生物合成调控具有重要的理论意义与应用价值。基于喜树碱生物合成途径的复杂性及其积累的时间、空间特异性,本研究选择生理状态的均一的喜树悬浮细胞作为研究材料,分析植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, Me JA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)以及水杨酸(salicylic acid, SA)对喜树碱合成途径中关键酶基因转录水平的调控。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测结果显示,MeJA、ABA、GA以及SA均可促进喜树碱合成色胺途径中关键酶基因CaTDC1以及下游CaSTR的表达,且在处理2 h左右达到峰值;MeJA、GA、SA主要调控环烯醚萜途径中关键酶基因Ca7DLGT、CaG8O、CaCYC1的表达,而ABA则显著调控色胺途径关键酶基因CaTDC1以及下游CaSTR的转录水平;4种激素中SA调控效果与其他激素相比极其显著。本实验排除了喜树碱合成时间、空间特异性影响以及植物向重性、激素浓度梯度等干扰因素,准确地分析了4种激素对喜树碱合成途径关键酶基因的调控,为后续研究植物激素...     

中科院揭示植物拮抗水杨酸驱动的应激反应的新组分

正近日,《The Plant Cell》在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心上海植物逆境生物学研究中心Chanhong Kim研究组研究论文,该论文报道了一种与脊椎动物心脏利钠肽(ANPs)功能相似的植物肽类激素PLANT NATRIURETIC PEPTIDE A(PNP-A),可以作为水杨酸信号的新型拮抗剂。植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)参与植物局部和系统获得性抗性(SAR),使植物整体产生对病菌的抗     

大豆抗SC3候选基因的克隆及分析

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要的病害之一,给我国大豆生产带来了巨大的损失。大豆抗病育种是目前防治大豆花叶病毒病最为经济有效的措施,发掘抗病基因是抗病育种的基础。本文在前期对大豆抗SMV株系SC3基因精细定位的基础上,克隆了2个具有TIR-NBS-LRR典型抗病结构域的基因(GmR47和GmR51)。生物信息学分析表明, GmR47和GmR51基因均在抗感品种中存在氨基酸位点的突变,而且突变位点都位于保守结构域内,这2个基因编码的蛋白质预测为烟草花叶病毒(TMV)抗性N蛋白;物种间同源比对结果显示, GmR47和GmR51基因与野生大豆亲缘较近。qRT-PCR结果表明, GmR47和GmR51能够响应SMV的侵染增加表达量,且在抗病品种中的表达量高于感病品种。2个基因存在IN1、IN2和IN3不同的剪接体,所有的剪接体都能够响应病毒的诱导增加表达量,且在抗病品种中的表达量高于感病品种, IN1和IN2的表达量随时间的变化较为明显, IN3的表达量则相对稳定,说明这些剪接体可能参与大豆对SMV的抗病过程。本研究为后续基因功能的研究奠定了基础。     

水杨酸诱导对苹果体内防御酶活性的影响

为研究叶面喷施水杨酸(SA)对不同苹果品种防御酶活性的影响,以抗病品种‘北之幸’和感病品种‘礼泉短富’为试验材料,对不同浓度水杨酸处理前后的苹果叶片进行防御酶活性测定。结果表明,经水杨酸处理后,‘北之幸’和‘礼泉短富’的β-1,3-葡聚糖酶、POD、PAL和PPO活性均有提高,且高于对照植株。其中‘北之幸’的β-1,3-葡聚糖酶、POD、PAL和PPO活性分别是对照的2.04倍,6.19倍,2.73倍和2.32倍;‘礼泉短富’的β-1,3-葡聚糖酶和PAL活性分别是对照的1.82倍和1.70倍,POD活性是对照的5.68倍,PPO活性是对照的4.00倍。由此可见,水杨酸处理可以不同程度的提高植株体内抗性相关酶的活性,但不同品种间存在差异。     

甘蔗脂氧合酶基因ScLOX1的克隆与表达分析

LOX属于脂氧合酶超家族(lipoxygenasesuperfamily),是脂肪氧化途径的重要因子,广泛参与植物生长发育的调节和对外界刺激的抵御。本研究基于甘蔗(Saccharumspp.)转录组数据库,通过RT-PCR技术,首次从新台糖22号(ROC22)蔗芽中克隆获得ScLOX1基因(GenBank登录号为MK106188)的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,ScLOX1基因cDNA序列长度为2813 bp,开放读码框全长2664 bp,编码887个氨基酸,其编码蛋白的理论等电点为6.23,不稳定系数为39.77,亲水性平均值为?0.437,无信号肽和跨膜结构,但含有PLAT_LH2和Lipoxygenase活性位点,与高粱(Sorghum bicolor) LOX (XP_002466613.1)的氨基酸序列相似性高达95.96%。预测ScLOX1基因的编码蛋白为酸性稳定亲水性非分泌蛋白,属于type I类非传统9-LOX。qPT-PCR分析结果显示,ScLOX1基因在蔗芽组织中特异性表达。接种甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)后, ScLOX1基因的表达量在抗病品种崖城05-179中短暂上升,但在感病品种ROC22中显著下降。分别对瞬时表达ScLOX1基因的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株叶片接种烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和青枯菌(Ralstonia solanacearum),表型观察、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色和烟草免疫相关基因的表达情况分析显示,ScLOX1基因的过表达能够增强本氏烟对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的防御,但对烟草青枯菌的作用与对照相比无明显差异。研究还发现,ScLOX1基因的表达受茉莉酸甲酯和水杨酸抑制下调,但受脱落酸、氯化钠和聚乙二醇诱导上调。以上结果为深入研究甘蔗ScLOX1基因的功能提供参考资料。     

BnaBZR1和BnaPIF4基因调控甘蓝型油菜弱光光效的机制

甘蓝型油菜品系XY881和XY883是湘油15辐照诱变后连续自交筛选的2个种子含油量、光合效率和弱光敏感性等有明显差别的子代品系。分别从XY881和XY883中克隆了芸薹素唑抗性因子1(brassinazole-resistant1,BnaBZR1)和光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4, BnaPIF4)基因并进行了序列结构、表达和功能分析。结果表明, XY883的BnaBZR1和BnaPIF4基因存在结构变异,引起表达和调控模式的差异。XY883中BnaBZR1的启动子具有124 bp的富含A/T的插入序列,且XY883具有比XY881高的BnaBZR1表达,并且在弱光和2,4-表油菜素内酯(2,4-BL)诱导下具有较少的表达变化。XY883中BnaPIF4的5'-UTR区域存在可变剪接,形成长度分别为424bp (U01)、239 bp (U02)和332 bp (U03)的3种5'-UTR,在弱光和2,4-BL诱导下, XY883中3种可变剪接的BnaPIF4转录产物的变化不一致。将BnaPIF4的3个5'-UTR与CDS分别组合转化拟南芥后其表达在转录水平无明显差异,但蛋白翻译存在明显差异,表明BnaPIF4的5'-UTR变异影响其翻译过程。转BnaPIF4基因拟南芥出现株高增加、叶片狭长且光合作用下降的表型,共转化BnaBZR1能减弱BnaPIF4造成的光合作用下降;转BnaPIF4和BnaBZR1基因对油菜的影响与拟南芥相似,但表型不如拟南芥明显,表明BnaPIF4是油菜光合作用的负调控因子,而BnaBZR1可对BnaPIF4的光合负调控产生拮抗;这与XY881和XY883中两基因表达调控模式及其光合表型相吻合。     

品种和栽培条件对草莓果实中水杨酸含量的影响

为了明确草莓内源SA（Salicylic acid,　简称SA）含量与其抗病性的关系,并探索人们从草莓等植物性食物中摄取SA的总量,本研究用HPLC分析比较了露地与设施栽培条件下五个对白粉病抗性不同的草莓品种果实的SA含量。结果表明,所测五种草莓红熟期果实内源总SA含量差别明显,露地栽培条件下为1.904µg/g～5.023µg/g,设施栽培条件下为1.068µg/g～4.201µg/g,与各品种的抗白粉病能力无明显相关性。草莓果实中SA均以结合态为主,五个品种结合态SA含量是游离态SA的4～20倍。游离态SA和结合态SA含量都随着果实的成熟而逐渐下降。说明草莓果实中内源SA含量不仅受基因型的影响,并且受栽培环境和成熟度的影响。     

水稻稻瘟病抗性基因Bsr-d1功能标记的开发和利用

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一, 选育抗病品种是防治该病害最有效的方法。Bsr-d1是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。为提高Bsr-d1基因在育种中的选择效率, 根据Bsr-d1与其感病等位基因bsr-d1在功能区域存在的单核苷酸差异, 设计和筛选出Bsr-d1基因不同类型的基因功能标记CAPs5-1和3Bsr-d1/3bsr-d1, 结合测序分析验证, 可准确鉴定出Bsr-d1的不同基因型。利用3Bsr-d1/3bsr-d1对34份籼稻品种、江苏历年来主要推广的110份粳稻品种、其他省份的13份粳稻品种、148份太湖流域地方粳稻资源和19份太湖流域地方籼稻资源进行了Bsr-d1基因型检测, 筛选到携带Bsr-d1基因的籼型资源11份, 271份粳型资源中均不携带Bsr-d1基因, 这也说明Bsr-d1主要分布在籼型水稻资源中, 在粳型资源中几乎不存在。本研究为Bsr-d1基因的育种利用和分子标记辅助选择奠定了基础。     

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前体基因ScPetC的克隆及表达分析

细胞色素b6f复合体还原型铁硫蛋白前体(Cytochrome b6f complex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由细胞核PetC基因编码的蛋白,其成熟蛋白参与构成细胞色素b6f复合体,是电子传递的重要元件。基于前期构建的受高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)侵染的甘蔗转录组数据库,从主栽甘蔗品种‘新台糖22号’叶片中成功克隆到该基因,并命名为ScPetC (GenBank登录号为MH333037.1)。生物信息学分析发现, ScPetC基因cDNA全长824bp,包含了一个678bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。ScPetC属于PRK13473超家族,其C末端具有典型的Rieske保守结构域;蛋白理论等电点为8.19,属于稳定的、亲水性蛋白;二级结构多为无规则卷曲,三级结构预测其比其他植物PetC多出一段α螺旋结构。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScPetC定位于叶绿体、细胞质和细胞膜。尽管前人研究表明, ScPetC的表达量会受SrMV侵染的影响,不同于半夏(Pinellia ternata) PetC与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) P1蛋白之间的互作, ScPetC不能与SrMV-P1蛋白互作,但能与甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) P0蛋白互作。实时荧光定量PCR分析表明, ScPetC基因在甘蔗不同组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高。甘蔗受脱落酸胁迫3 h时, ScPetC表达量显著上调,但是随着处理时间的延长,表达受到抑制;在茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化铜、氯化镉和氯化钠胁迫下,ScPetC表达量均显著下调。本研究通过对ScPetC生物学功能、环境外源激素与重金属等胁迫下的表达模式及其与甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究,增加了对甘蔗PetC的了解,也为深入研究其在甘蔗受黄叶病毒侵染中的作用奠定基础。