罗汉松和珙桐内生真菌的分离及其多样性研究

为了深刻认识罗汉松和珙桐内生真菌的多样性,分离了183株罗汉松和珙桐内生真菌,结合形态学和分子分类方法对分离内生真菌进行种属鉴定;采用限制性片段长度多态性(RFLP)方法研究分离菌株的遗传多样性。结果表明96株罗汉松内生真菌鉴定为曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、拟茎点霉属Phomopsis、丝枝霉属Aphanocladium、脉孢菌属Neurospora和无孢菌群,Shannon多样性指数为1.73;87株珙桐内生真菌分属于曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、拟茎点霉属Phomopsis、青霉属Penicillium、炭角菌属Xylaria sp.和无孢菌群,Shannon多样性指数为1.53。采用RFLP方法,对全部内生真菌rRNA基因间隔区(ITS)的核苷酸多样性进行了分析,罗汉松和珙桐内生真菌分别聚为22个分枝,同属的菌株聚在一起,同属菌株的RFLP分类相似性在93%以上。罗汉松和珙桐内生真菌中都有无孢菌群,部分菌株与鉴定菌株同处一个分枝中,其他相距较远的无孢菌可能为新的种属。本研究结果提示,罗汉松和珙桐内生真菌的多样性丰富。     

禾谷孢囊线虫生防真菌的分离鉴定及初步应用

禾谷孢囊线虫病是我国小麦产区主要的病害之一,对农业生产造成了极大的损失。通过从孢囊上分离寄生真菌,扩增其ITS序列,并通过室内生测和盆栽试验对其发酵液进行了杀线虫活性测定。结果表明,共鉴定获得31株真菌,分别属于镰刀菌属、支顶孢属、枝孢属、曲霉属、链格孢属、毛壳菌属、枝氯霉属、根霉、小球腔菌属、青霉菌属10个属,其中镰刀菌属真菌最多有8株。黑曲霉属真菌HN214与曲霉属真菌HN132的发酵液稀释4倍后,对禾谷孢囊线虫的校正死亡率分别为99．66％和96．56％;室内盆栽活性测定表明,真菌HN132的8倍发酵液处理后,禾谷孢囊线虫的孢囊减少率达64．1％,在生产上具有较好的开发前景。     

两株马铃薯干腐病病原菌的分离和鉴定

确定马铃薯窖储主要真菌病害马铃薯干腐病的致病菌株,为科学防治提供依据.从黑龙江省哈尔滨地区具有典型马铃薯干腐病症状的薯块中分离获得了2个镰刀菌菌株,通过生物学特征、致病性测定和ITS序列分析进行鉴定.根据测定菌株的生长速度、菌丝形状、菌落色泽、基物表面色泽等初步确定2个致病菌株为黄色镰刀菌(F.culmorum)和燕麦镰刀菌(F.avenaceum),两菌株对离体块茎的致病率分别为41.05％和72.20％.2.个菌株的ITS序列与GeneBank中的黄色镰刀菌和燕麦镰刀菌的完全一致,相似度均达到100％,也验证了依据传统特征的鉴定结果.明确了黄色镰刀菌为我国马铃薯干腐病的致病菌.     

青麦仁冻藏期内菌相分析及优势菌的分离鉴定

为了对青麦仁冻藏期间微生物进行控制,本研究利用选择性培养基对冻藏期间青麦仁的菌相进行分析,应用形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析法鉴定速冻青麦仁的优势菌株,探讨青麦仁冻藏期内菌相构成及优势微生物种类。结果表明,青麦仁冻藏期内细菌总数为3.76 lg(CFU/g),经分离纯化后得到特异性细菌菌株28株、真菌3株,菌落基本形态观察及菌落总数计数得到速冻青麦仁中优势菌群3株,经生理生化鉴定及16S rDNA序列测定可知速冻青麦仁中的3株优势菌分别为:QX-1鞘氨醇单胞菌属、QX-4微杆菌属和QX-26不动杆菌属。     

产生物碱的甘肃贝母内生真菌的筛选、鉴定及抑菌活性测定

为了探索甘肃贝母(Fritillaria przewalskii Maxim.)内生真菌的应用价值,以甘肃贝母为材料,研究其内生真菌生物碱类代谢产物的多样性及抑菌活性。利用生物碱沉淀反应和薄层色谱技术(thinlayer chromatograph TLC)检测生物碱类成分,依据平板打孔法测定其抑菌活性,结合形态特征和内转录间隔区(internal transcribed spacer ITS)序列鉴定菌株。从甘肃贝母的健康鳞茎中分离得到13株内生真菌,其中,菌株G6能产生多种生物碱物质。但薄层色谱分析表明,菌株G6代谢的生物碱成分与川贝类生物碱并不一致。测定其抑菌活性发现,总生物碱提取液对金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果而对粪肠球菌的抑制作用中等。结合形态学特征及ITS序列信息,菌株G6被鉴定为镰刀菌属接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)。虽然菌株G6并不能产生与寄主相同的生物碱物质,但其在新生物碱及抑菌化合物的开发利用方面具有一定的价值。     

2013年粳稻4t实仓储藏一年后优势菌种的分离与鉴定

稻谷极易受到微生物的侵染,粮食微生物的活动不仅会影响到粮食的安全储藏,导致粮食腐坏变质,还会严重影响食用者的身体健康.采用GB 4789.15-2010对稻谷进行传统培养,并从中分离得到两株优势菌株.对分离出的优势菌株进行形态学观察,观察菌株在不同生长时期的形态及菌丝、孢子形态,初步判定两菌株均为曲霉.同时运用聚合酶链式反应对两菌株的ITS及28S片段进行扩增,扩增得517bp的ITS片度及560 bp的28S片段,将基因序列在Genbank中进行相似性比对,最终确定两菌株为溜曲霉(Aspergillus tamarii)和亮白曲霉(Aspergillus candidus).     

红花龙胆内生真菌多样性分析及抑菌活性菌株筛选

为了明确民族传统中药材红花龙胆(Gentiana rhodantha Franch. ex Hemsl)内生真菌群落结构及功能,本研究采用组织块分离法,对贵州省六盘水地区的野生红花龙胆内生菌进行分析,结合形态特征和ITS序列对分离的菌株进行鉴定,并阐述内生菌多样性;采用平板对峙法筛选能显著抑制红花龙胆菌核病菌(Sclerotinia sclerotionrum)生长的内生菌株。结果表明:从六盘水地区钟山凤凰、水城南开、水城杨梅和六枝新场等4个点的480个野生红花龙胆组织块中分离获得294株内生真菌,隶属32个属,总定殖率和总分离率分别为49.38%和61.25%,内生真菌多样性非常丰富。从总体分离频率分布来看,镰刀菌属(Fusarium)(9.86%)和刺盘孢属(Colletotrichum)(8.84%)为优势菌群。多样性分析结果显示,六枝新场的红花龙胆内生菌多样性程度最高,在不同部位中茎秆的内生真菌多样性大于叶片和根部。通过与丝核菌进行对峙培养筛选出抑制率超过50%的有23株内生真菌,其中葡萄座腔属的R022、R021、拟茎点霉属的S002、刺盘孢属的S028以及镰刀菌属的L031等5株内生菌对红花龙胆菌核病菌菌丝抑制率均超过70%,具有较大的生防潜力。本研究初步探明红花龙胆内生真菌多样性,并为红花龙胆菌核病生物防治研究奠定基础。     

菜豆种子携带病原真菌的检测及其致病镰刀菌的室内药剂筛选

以京津冀地区4个菜豆主栽品种为材料,开展菜豆种子携带真菌病原的检测研究,并测定4种常用种衣剂对种子携带致病镰刀菌的药剂敏感性。通过吸水纸检测和PDA平板法对4个菜豆品种进行种子外部和内部带菌检测。结果表明,菜豆种子上携带的致病病原为镰刀菌属(Fusarium spp.)和链格孢属(Alternaria spp.)2种,还携带曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、木霉属(Trichoderma spp.)和毛壳菌属(Chaetomium spp.)类腐生菌。种子内部寄藏真菌较少,疑似病原菌检出率显著降低。对种子上分离的镰刀菌进行致病力鉴定,32株分离到的镰刀菌中获得4株致病菌株。通过生长速率法测定4株致病镰刀菌对4种常用种衣剂的药剂敏感性,发现25g/L咯菌腈悬浮种衣剂对镰刀菌抑制作用较强,EC50为0.596~2.173mg/L。     

甘蓝种传镰刀菌的鉴定及其致病性研究

针对春甘45和红亩紫甘蓝种子上分离得到的两株镰刀菌(Fusarium-CG和Fusarium-HM),结合形态学特征及rDNA ITS序列分析进行了鉴定,并研究了其对甘蓝种子发芽的影响和幼苗的致病性。结果表明:2株镰刀菌均为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum);对甘蓝种子发芽有一定的影响,发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数等指标均降低,其中106个/mL孢子悬浮液处理后,活力指数显著降低;能导致甘蓝幼苗出现典型的枯萎症状,柯赫氏法则检验证明其具有致病性。甘蓝种子传带尖孢镰刀菌并具有致病性为国内首次报道。     

龙眼采后腐烂相关细菌与真菌的分离与鉴定

采用稀释涂布平板法,从龙眼腐烂果实中分离细菌和真菌,并结合菌落形态观察以及16S rDNA和ITS序列分析对所分离的细菌和真菌进行鉴定。结果表明,采用稀释涂布平板法,从龙眼腐烂果实中分离得到11株细菌和7株真菌。菌落形态观察以及16S rDNA和ITS序列分析结果表明,所分离的细菌主要鉴定为奥斯陆莫拉菌、短小芽胞杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜状明串珠菌和东方醋酸菌。所分离的真菌主要鉴定为淡色生赤壳菌、葡萄座腔菌科真菌、间座壳菌、疖葡萄座腔菌和木贼镰孢菌。从龙眼腐烂果实中分离到的细菌和真菌目前在龙眼采后病害中未见相关报道,对于其致病性检测还有待于进一步的回接验证,以明确导致采后龙眼果实腐烂的主导微生物。     

戊唑醇对洋葱贮藏期干腐病致病镰刀菌抑制效果较好

正为明确洋葱贮藏期干腐病致病镰刀菌的病原菌,甘肃农业大学、甘肃省农科院研究人员采用形态学与分子生物学方法对洋葱干腐病病原种类进行了鉴定,在CLA培养基上对两株典型菌株的菌落形态和培养特征进行了观察和描述。r DNA-ITS序列测定和同源性比对结果表明,两菌株的ITS序列分别与Gen Bank数据库已知尖孢镰刀菌和层出镰刀菌的同源性均达99%,其     

银川大豆根腐病病原鉴定及种衣剂对其防治效果

为明确宁夏银川地区大豆根腐病病原及种衣剂对其防治效果,于2018—2019年从宁夏银川贺兰、兴庆和永宁地区大豆产区采集大豆根腐病病样,采用组织分离法分离病原菌,通过形态学鉴定并结合ITS和TEF序列分析确定病原菌的分类地位;通过田间试验明确6种种衣剂对大豆根腐病的防治效果。分离纯化获得126株镰刀菌,属于4个种,分别为茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、木贼镰刀菌(F. equiseti)和短肥镰刀菌(F. brachygibbosum),占比分别为51.59%、24.60%、13.49%和10.32%。4种镰刀菌对大豆均有致病作用,造成根腐病症状。供试6种种衣剂在播种后20天的防治效果均在65%以上,60天后防治效果均在60%以下。造成宁夏银川地区大豆根腐病的病原菌为茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌和短肥镰刀菌。供试种衣剂对大豆根腐病均有一定的防治效果,但在大豆成株期防治效果下降。     

药用植物滇黄精寄生真菌的分离与鉴定

为了解滇黄精寄生真菌及其优势居群,采集滇黄精种植区云南省丽江地区玉龙县和华坪县的样品,采用组织分离法、样品保湿法和三点接种法分别对滇黄精寄生真菌进行分离、培养和纯化。对纯化菌株进行传统形态学及分子生物学鉴定。玉龙县鲁甸乡采集到15株寄生真菌（1株青霉属Penicillium、12株尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、1株木贼镰刀菌Fusarium equiseti、1株链格孢菌Alternaria alternata）,华坪县采集到22株滇黄精寄生真菌（12株黑绿木霉Trichoderma atroviride、9株芬芳镰刀菌Fusarium redolens、1株木贼镰刀菌Fusarium equiseti）。2个试验地所采集的滇黄精镰刀属真菌菌株占比较大,为优势寄生真菌,研究结果将为滇黄精病害防治提供理论依据。     

腌蛋盐水中致腐菌的分离鉴定

咸蛋加工企业普遍面临腌蛋腐败变质问题,夏季尤为显著,本研究为了找出导致腌蛋腐败的微生物。故采用平板稀释法对腐败腌蛋盐水进行微生物分离,共获得20株耐盐菌,经过反证法将菌株反接到腌蛋盐水中进行腌蛋,以咸蛋的腐败率为指标,筛选出对腌蛋具有较强致腐率5株菌。采用菌株形态学观察、生理生化检测,结合16S rDNA及18S rDNA序列分析,鉴定其中3株属于葡萄球菌属(Staphylococcus),1株奇异变形杆菌属(Proteus),1株织球壳菌属(Plectosphaerella)。     

传统豆酱发酵过程中霉菌的形态学分析

本试验是以传统微生物学方法对自然发酵豆酱中的霉菌进行形态学分析,初步探究豆酱发酵过程中霉菌菌群的变化规律,探索在传统豆酱发酵过程中霉菌的组成及优势菌株,这对于豆酱发酵起到关键作用。对不同发酵时间的豆酱样品中的霉菌进行计数、分离,并通过载片培养法对其进行鉴定。利用传统分离培养的方法从传统发酵豆酱中分离得到6株具有代表性的霉菌,对每类中具有代表性的菌株进行进一步的真菌湿室培养法鉴定后,确定了其种属地位,分别为：米曲霉、大毛霉组、犁头霉属、总状枝毛霉组、雅致放射毛霉组和曲霉属,其中米曲霉是优势菌。本研究揭示了豆酱发酵过程中霉菌的菌相组成,这为将豆酱生产由传统制备转向工厂化生产提供了菌株基础。     

冬瓜枯萎病菌核糖体rDNA ITS区的克隆与序列分析

采用镰刀菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增冬瓜枯萎病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆和序列分析;利用Mega 4.1软件对序列及GeneBank中以葫芦科为寄主的镰刀菌不同专化型ITS序列进行聚类。冬瓜枯萎病菌ITS全长1 063 bp,其中包括18S rDNA一部分序列,5.8S rDNA,ITS1和ITS2全部序列及28S rD-NA部分序列。聚类结果将15个菌株ITS序列划分为2个类群,类群I包括4个菌株,分别为2个西瓜枯萎病菌株和2个甜瓜枯萎病菌株;类群II包括11个菌株,其中冬瓜枯萎病菌株就在该类群中,其余为甜瓜枯萎病菌株5个、西瓜枯萎病菌株3个、黄瓜枯萎病菌株、丝瓜枯萎病菌株和葫芦枯萎病菌株各1个。     

罗田栗实致腐真菌的分离鉴定及拮抗菌筛选

采用组织分离法,从无症和显症的罗田板栗栗实中分离致腐真菌,再利用形态学特征与真菌ITS rDNA序列分析相结合的方法鉴定分离真菌。结果表明,分离真菌经鉴定分属11个种：匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、栗疫菌(Cryphonectria parasitica)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、扩展青霉(Penicillium expansum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus luteolus)、白假丝酵母(Candida albicans);其中栗疫菌(Cryphonectria parasitica)和扩展青霉(Penicillium expansum)的分离率最高。供筛的6株拮抗细菌的平板对峙实验表明：丁香假单孢杆菌和荧光假单胞杆菌对板栗致腐真菌有抑制作用,其中荧光假单孢杆菌对板栗主要致腐真菌ITS4和ITS6的抑制圈直径超过10mm。     

海南辣椒尖孢镰刀菌拮抗内生细菌的分离与鉴定

为了获得对辣椒尖孢镰刀菌具有较好防治效果的内生细菌,课题组于2022年1～3月份在海口、定安、澄迈、临高和陵水等海南辣椒主产区采样,并从健康辣椒样品中分离获得内生细菌192株,其中39株对辣椒尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) CMTT4-1有拮抗作用,分别来源于根系(23株)、茎秆(2株)、叶片(8株)和果实(6株),有拮抗作用菌株占比20.31%,抑菌率为10.68%～59.02%。通过形态学和16S rDNA序列测定及同源性分析,初步鉴定芽孢杆菌属(Bacillus spp.)细菌36株、短杆菌属(Brevibacterium spp.) 1株、农杆菌属(Agrobacterium spp.) 1株和假单胞菌属(Pseudomonas spp.) 1株。研究结果为辣椒枯萎病的生物防治提供了菌株来源。     

甘草产香内生真菌RP2的初步鉴定及挥发性成分分析

为了开发甘草内生真菌RP2次生代谢产物的资源,丰富挥发性香味成分的获取途径,以甘草内生真菌RP2为研究对象,采用形态学观察及ITS序列分析法对其进行菌种鉴定,通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对甘草内生真菌RP2挥发性成分进行分析。甘草内生真菌RP2经鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。在甘草内生真菌RP2发酵液中分离并鉴定出11种挥发性成分;在甘草内生真菌RP2菌丝体中分离并鉴定了6种挥发性成分。甘草内生真菌RP2挥发性成分中含有多种现有工业生产中广泛应用的挥发性香味成分,如2-苯基乙醇等。本研究对开发利用甘草内生真菌RP2具有重要意义。     

甘肃省张掖市玉米黑髓病病原的分离与鉴定

为明确引起甘肃省张掖市玉米黑髓病的病原菌种类,于2021年9月,在甘肃省张掖市采集具有典型病害症状标本,利用组织分离法进行分离纯化,并通过柯赫氏法则验证致病性;利用形态学特征和分子生物学方法进行鉴定。结果表明,于病样中共获得39株分离物,能引起与田间症状相一致的病原菌30株,表现症状为根茎腐烂型、根腐型和茎腐型3类。根据形态特征将30株病原物均鉴定为镰孢霉属真菌,结合分子生物学方法将30个致病镰孢霉菌分别鉴定为拟轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、层出镰刀菌(F.proliferatum)、茄病镰刀菌(F.solani)、变红镰刀菌(F.incarnatum)和柔毛镰刀菌(F.flocciferum),其分离频率依次为50.00%、20.00%、16.67%、6.67%、3.33%和3.33%,其中拟轮枝镰刀菌为张掖市玉米黑髓病的优势致病菌,首次报道柔毛镰刀菌可以侵染玉米。该研究结果为玉米黑髓病的诊断和防治提供了依据。