以RNA干扰γ-氨基丁酸转氨酶1基因(OsGABA-T1)表达提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,具有降血压等功能。为提高稻米中GABA含量,利用RNA干扰技术,构建水稻中GABA代谢关键酶GABA转氨酶1基因(Os GABA-T1)的干扰载体,通过农杆菌介导法,将其转化至粳稻品种宁粳1号中。实时荧光定量PCR检测结果表明导入的RNA干扰结构成功地降低了目的基因Os GABA-T1的表达,且干扰家系中Os GABA-T2基因表达也随之下降。对转基因T3代稻米GABA含量测定发现,糙米中GABA含量相对于对照增加了13倍以上,精米中GABA含量也显著增加,而其他主要氨基酸含量则没有明显变化。测定储藏4个月的转基因稻米发现,GABA含量仍具有较高水平。所以,利用RNA干扰技术可有效提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量,为培育富含GABA的降血压功能性水稻品种提供基础。     

元麦β-葡聚糖含量的差异性及其影响因素的研究进展

元麦膳食纤维含量丰富,β-葡聚糖含量高,保健功效强,是重要的功能性农产品。为了全面了解不同地区元麦β-葡聚糖含量的差异性及其影响因素,本研究对全国7个不同省份元麦棱型、粒色、β-葡聚糖含量进行了整理和归纳,分析了气候、遗传育种和栽培措施等方面对元麦β-葡聚糖含量的影响。针对有关元麦β-葡聚糖合成筛选的有效基因少,气候与栽培措施对元麦β-葡聚糖的影响较大等问题,提出如下解决建议：（1）通过全基因组关联分析定位筛选相关位点与候选基因,挖掘与利用和β-葡聚糖合成相关的关键或主导基因,为元麦营养育种提供分子基础。（2）实际生产中根据当地气候条件,选择高产高β-葡聚糖含量的加工用营养元麦品种,采用适宜的栽培措施,缓解不良生长环境的影响。元麦分子育种和适宜的栽培措施有助于提高元麦生长适应能力,稳定元麦β-葡聚糖的含量,保障高品质元麦原料,推动健康农业的发展。     

外源硒对60Co-γ辐射下菜豆幼苗生长和生理的影响

为探讨外源硒对⁶⁰Co-γ辐射下菜豆幼苗生长以及生理的影响,以菜豆品种‘13-6-1-2’和‘紫冠’为试验材料,通过外源喷施50 μg/mL的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)溶液,研究⁶⁰Co-γ辐射(120 Gy)下外源Se对菜豆的表型、抗氧化酶活性(POD、SOD、CAT)、丙二醛(MDA)、叶绿素以及硒含量的影响。结果显示,⁶⁰Co-γ辐射下外源硒显著提高了菜豆幼苗体内的硒含量,也不同程度提高了抗氧化酶活性及MDA和叶绿素的含量。研究表明,叶面喷施适当浓度的外源硒可以促进菜豆的生长发育,提高菜豆自身的硒含量,提高其抗氧化能力,缓解⁶⁰Co-γ射线对菜豆幼苗生长的影响。     

巨胚水稻W025糙米浸水后γ-氨基丁酸含量变化的研究

富含γ-氨基丁酸（GABA）的降血压功能水稻正受到越来越多的关注。W025是通过化学诱变和杂交选育而成的水稻新品系,具有巨胚特征,遗传分析表明巨胚基因受单隐性基因控制。进一步研究W025和其原始品种金南风浸水后γ-氨基丁酸（GABA）含量及其合成关键酶——谷氨酸脱羧酶活性的动态,并用半定量RT-PCR检测了2个谷氨酸脱羧酶转录本在浸水过程的表达变化。结果表明,（1）GABA主要集中在胚部,浸水后W025的GABA积累量显著高于金南风。（2）随着浸水时间延长,谷氨酸脱羧酶（GAD）的活性呈逐渐增加趋势,W025胚部的酶活性显著高于金南风。GAD活性的变化与GABA的积累显著正相关,表明浸水后种胚GABA的积累与谷氨酸脱羧酶的催化反应有关。（3）2个谷氨酸脱羧酶基因OsGAD1与OsGAD2在W025和金南风之间没有转录水平的差异。提示可能存在其它的谷氨酸脱羧酶基因对浸水后GABA的积累起关键作用。     

基于分子蒸馏技术紫苏油α-亚麻酸纯化效果的研究

为了探究分子蒸馏技术纯化紫苏油α-亚麻酸的可行性,筛选紫苏油提取方法的基础上,考察了蒸馏温度、蒸馏压力、刮板转速和进料速度4个因素对分子蒸馏技术纯化α-亚麻酸效果的影响。结果表明,紫苏油最佳提取法为超临界CO₂萃取法,α-亚麻酸纯化的首要影响因素是蒸馏温度,其次是蒸馏压力,再次是进料速度,最后是刮板转速。最佳纯化工艺：蒸馏温度220℃,蒸馏压力0.07 mbar,刮板转速375 r/min,进料速度1.0 d/min,该工艺条件下α-亚麻酸纯度达到97.42%。该方法有效提高了紫苏油α-亚麻酸的纯度,为高纯度α-亚麻酸的研究和利用奠定了理论基础。     

大豆FAD2-1b 基因沉默载体的构建

旨在培育生物安全的转基因大豆。设计引物、采用RT-PCR从高蛋白大豆品种‘黑农35’中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆‘黑农37’中克隆FAD2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆品种中克隆FAD2-1b基因片段,作为正向臂和反向臂。连接这些目的片段,构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为FAD2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,扩增得到的重组质粒经酶切和序列分析鉴定正确,命名为pDT-FAD2I。本研究构建了针对大豆FAD2-1b基因的沉默载体,为进一步获得FAD2-1b基因沉默大豆,培育转基因安全的高品质大豆奠定了基础。     

桑叶中γ-氨基丁酸含量的测定

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,简称GABA）是动物中枢神经系统中的一种主要的抑制性神经递质,也是广泛地存在于植物体内的一种与逆境胁迫有关的非蛋白氨基酸。实验探索出了适合桑叶的测定方法为比色法,利用AlCl3有效去除桑叶中的水溶性色素后,采用分光光度法准确地测定桑叶中GA-BA的含量。同时,对目前生产上主要栽种的23个桑树品种的GABA的含量进行了测定,其结果显示含量较高的桑树品种为火桑,其新鲜桑叶中GABA的含量为1.224mg/g,为GABA的进一步研究和桑叶中功能性成分的开发利用奠定了试验理论基础。     

DABS-Cl柱前衍生-HPLC测定稻米中γ-氨基丁酸方法优化

建立4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱测定稻米γ-氨基丁酸（GABA）含量的方法。样品采用80%的乙醇溶液提取后,1.0mL样液依次加入0.20mL碳酸氢钠和0.40mL DABS-Cl在70℃下衍生20min,利用C18色谱柱,乙腈-三水合乙酸钠溶液作为流动相在436nm波长下测定GABA含量。结果显示：GABA在糙米和精米的添加回收率大于87.60%,相对标准偏差小于9.07%;GABA在1.0~100.0mg/L内具有良好的线性关系,相关系数为r=0.9995（n=3）。用本方法测定了14种糙米和精米样品的GABA,其含量为6.38~108.7mg/kg,湖南精米和糙米中的GABA含量最高。     

γ-氨基丁酸对甘草种子萌发及呼吸代谢的影响

以甘草种子为材料，测定不同浓度的γ-氨基丁酸(GABA)处理及GABA抑制剂处理后甘草种子的动态质量、吸胀速率、发芽率、发芽指数、呼吸速率、活力指数以及呼吸代谢物有机酸和氨基酸的含量，探究GABA对甘草种子萌发及呼吸代谢的影响。结果表明，外源GABA处理在一定程度上能够提高甘草种子的萌发指数、活力指数、质量和呼吸速率，其中，2 mmol/L GABA处理的种子活力指数和萌发指数较高，分别是对照组的1.45倍和1.38倍(p<0.05),处理48 h时质量为对照的1.05倍；一定浓度外源GABA处理可以提高种子内部GABA、琥珀酸等呼吸相关代谢物的含量；一定浓度GABA抑制剂处理能够降低甘草种子的呼吸速率和增加种子质量，48 h时的呼吸速率为对照组的92.86%,抑制剂同时可以降低延胡索酸和琥珀酸的含量。研究表明，一定浓度的GABA处理有利于甘草种子萌发，能够提高种子内源GABA以及其他呼吸代谢物的含量，促进三羧酸循环。     

RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响

为探讨RNA干扰水稻SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响,以水稻品种中花11及以其为受体的转基因株系为材料,分别检测水稻SBE3基因的表达、籽粒发育各时期淀粉合成关键酶活性变化及直链、支链淀粉相对含量。结果表明,导入的SBE3基因RNA干扰结构成功地降低了目的基因的表达,并使其酶活性在籽粒发育各时期均显著降低并提前3 d达高峰期,且不同株系间具有差异。同时也使不同发育时期籽粒的ADPG-PPase和SSS及DBE活性均不同程度地显著降低,尤其以SSS和ADPG-PPase活性峰值降幅最大。此外,两个转基因水稻株系各时期籽粒直链淀粉含量均显著高于对照,而其成熟籽粒千粒重却显著降低,直链淀粉含量越高,千粒重越轻。     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

有色糙米发芽过程中游离氨基酸含量的动态变化

旨在了解有色糙米随着发芽时间的延长,人体利用率高的游离氨基酸含量及组分配比变化特点。选取红米(BP480)、黑米(BP602)和白米(BP015, CK)的糙米材料,进行发芽处理,在发芽后9个不同时间点(24、30、36、42、48、60、72、84、96 h)对γ-氨基丁酸及其他17种氨基酸进行检测,分析γ-氨基丁酸、必需氨基酸、限制氨基酸、风味氨基酸的动态变化。结果表明有色米（红米、黑米）和白米大部分游离氨基酸（包括γ-氨基丁酸）含量呈持续增长趋势,发芽96 h达到最大值,并且必需氨基酸所占总游离氨基酸含量的百分比不断升高,红米从20.3%升到48.0%,黑米从19.2%升到48.1%,白米从16.6%升到49.2%。苏氨酸成为含量最高的游离氨基酸。发芽可以改善糙米游离氨基酸的组成特性,显著提高糙米蛋白成分的利用率。     

Construction of RNAi Vector of Cotton (Gossypium hirsutum L.) FAD2-1 Gene and Acquisition of New High Oleic Acid Germplasm

[Objective] Here, the aim was to create a new cotton (Gossypium hirsutum L.) germplasm with high oleic acid and low linoleic acid contents without affecting the fiber yield and quality. [Method] The fatty acid desaturation 2-1 (FAD2-1) gene catalyzes the formation of polyunsaturated linoleic acid from monounsaturated fatty acid in cotton. The protein’s properties, structure and functions were analyzed using the information analysis method. A conserved 381-bp fragment of GhFAD2-1 was cloned to construct an RNA interference vector, which was transformed into cotton by Agrobacterium-mediated hypocotyl infection. The fatty acid compositions and contents of T₂―T₄ transgenic plants were determined using gas chromatography-mass spectrometry. The T₄ transgenic lines were used to investigate the copy number, target gene expression, agronomic traits, and fiber quality. [Results] The RNA interference vector of GhFAD2-1 was successfully constructed and transformed into cotton. The target gene’s expression level was significantly lower in transgenic plants than in controls. The transgenic plants had high oleic acid and low linoleic acid contents, which could be stably inherited by the offspring. The oleic acid contents of transgenic cotton seeds increased by 224.1%, and the linoleic acid content decreased by 237.5%, compared with the control seeds. There were no significant differences in the agronomic traits and fiber quality of the transgenic lines compared with the control. [Conclusion] These results verified the function of GhFAD2-1 in cotton and provide a basis for breeding cotton varieties with high oleic acid contents.     

OsMYB调控化感水稻酚酸类物质合成及其抑草作用

基因表达调控是水稻化感作用形成的重要基础。本研究对化感水稻PI312777(Oryza sativa L.)的Os MYB(CT829537)基因分别进行过表达(overexpression,OE)和RNA干扰(RNAi),再与稗草(Echinochloa crusgalli,BYG)共培养,以野生型PI312777为对照。结果发现,与稗草共培养下CT829537-OEPI312777的酚类代谢关键酶基因表达上调,根系及其水培液中的总酚酸浓度增加,抑草能力增强;相同处理下CT829537-RNAi PI312777则相反,其酚类代谢关键酶基因较野生型植株表达下调,总酚酸浓度降低,抑草能力下降。这表明Os MYB(CT829537)通过调节化感水稻的酚酸类物质合成进而影响其抑草能力。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。     

农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一,生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因,成熟子叶节为外植体,采用农杆菌介导法获得了22株T₀代转基因大豆生根苗,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定,获得RNAi CP转基因植株18株;对转基因植株T₁代的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;T₁代Southern杂交表明,导入的干扰片段为单拷贝;花叶病毒摩擦接种表明RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性;摩擦接种后3周,DAS-ELISA检测进一步表明,RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%,而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。     

Modification of plant height via RNAi suppression of OsGA20ox2 gene in rice

GA 20-oxidase (GA20ox) is a regulatory enzyme for the syntheses of biologically active GAs in plants. The loss-of-function mutations in OsGA20ox2 of rice (Oryza sativa L.) generate the well-known Green Revolution gene sd-1, which cause the semi-dwarfism phenotype. In our present investigation, semi-dwarf plants were generated from a taller rice variety QX1 by RNAi suppression on the expression of OsGA20ox2. The 531bp-fragment of OsGA20ox2 was amplified by PCR from genomic DNA of QX1 and used to construct the hairpin RNAi vector pCQK2. The wild type QX1 was transformed with pCQK2 by Agrobacterium-mediated transformation and some independent transgenic RNAi lines exhibited semi-dwarfism. RT-PCR and Northern blot analyses showed that the expression of OsGA20ox2 was specifically suppressed in the RNAi semi-dwarf lines. Endogenous GA assays revealed that the contents of the GA20ox2-catalyzed products GA₁₉, GA₂₀ and the down-stream biologically active GA₁ were drastically reduced in the RNAi semi-dwarf lines. We further showed that the RNAi semi-dwarf lines could be restored to normal plant height by applying exogenous GA₃. The results indicated that the semi-dwarfism of the RNAi semi-dwarf lines was associated with the decreased expression of OsGA20ox2 gene and the reduced content of endogenous biologically active GA₁. Analyses of panicle length, seeds per panicle and 1000-grain weight suggested that the RNAi semi-dwarf lines showed stable grain yield compared with the wild type plants. It is demonstrated that the RNAi approach could be useful for plant breeding purposes in the future. Qing Yang, Chun-Lian Wang have contributed equally to this work.     

RNA干涉机制的研究进展及植物学意义

RNA干涉(RNAi)是指由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,其中small RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中起关键作用。本文综述了RNAi中siRNA和microRNA分别介导的作用机制,RNAi在植物中的研究现状,主要包括转基因植物中的RNA干涉和植物病毒诱导的RNA干涉等方面的研究概况。评述了RNAi在植物学研究中的意义,主要包括功能基因的研究、转基因植物的研究及植物抗病性研究。