不同抗冷级别的棉苗低温诱导蛋白比较

通过蛋白质双向电泳和质谱技术,对低温前后不同抗冷级别的棉花品种锦3047和410的蛋白质组进行了比较分析。结果表明:⑴不同品种的棉苗蛋白质组有明显差异,锦3047在pH4~7条件下的棉苗子叶蛋白表达图谱中发现50个蛋白点在低温胁迫前后的表达量有明显差异。⑵其中30个点在低温前后均有表达,低温处理后,有19个蛋白点的丰度值变大,且抗冷性较强的锦3047绝对丰度明显高于抗冷性较弱的410;11个蛋白点的丰度值变小,锦3047的绝对丰度低于410。⑶锦3047特有8个蛋白点表达量上升,而在410中几乎不表达。⑷对入选的锦3047的差异蛋白点进行质谱分析,并通过数据库检索进行蛋白质鉴定,得到了其中30个蛋白的完整肽指纹图谱。其中逆境蛋白占20%,这些蛋白的表达可能对锦3047的抗冷性具有重要作用。     

蛋白质组学研究中的质谱鉴定与生物信息学分析

 以陆地棉TM-1开花后6 d的胚珠为对照,比较开花后6、10、14、18、22 d纤维的蛋白质组双向电泳图谱,从中选取了编号为37的差异表达的蛋白质点。胶内胰蛋白酶酶切的多肽,用AB 4700 蛋白质组学分析仪进行MALDI-TOF/TOF分析,获得了该点内蛋白质的高品质肽质量指纹图谱（PMF）,从中挑出质量为1517.9的肽离子进行串联质谱分析,获得碰撞后断裂片段离子的串联质谱(FFP)。将获得的PMF分别用MASCOT、ProFound、Aldente和MS-Fit等常用软件对NCBInr和UniProt数据库中的绿色植物蛋白质数据库进行搜索,并用MASCOT搜索本地棉属EST数据库。将获得的FFP用MASCOT软件的离子搜索模式和序列查询模式搜索数据库结合手工质谱解析推断序列,最后确认该蛋白质是羟甲基转移酶。本文着重讨论了蛋白质组学研究中质谱分析和生物信息学软件的应用,评价常用蛋白质组学PMF检索工具及其检索结果。     

陕农138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析

为了寻找小麦单核中晚期愈伤组织诱导率较高的原因,探讨小麦花药发育的蛋白质代谢机制,本试验利用双向电泳技术对陕农138小麦小孢子单核中晚期和双核期的全蛋白分析表明,在等电点4~7之间可识别约450个以上清晰的蛋白质点,检测到差异点26个,对其中14个质量较好、重复性较高的差异表达的蛋白质点采用基质辅助激光解吸分离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽指纹图谱分析,并利用Mascot软件在NCBInr数据库搜索,鉴定出11个蛋白质点,另3个蛋白质点未得到有意义的鉴定,11个蛋白质点分别被鉴定为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(1个蛋白点)、叶绿素抗体结合蛋白(1个蛋白点)、pentatricopeptide重复蛋白PPR566-6 (1个蛋白点)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(1个蛋白点)、泛素(1个蛋白点)、S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶(2个蛋白点)、放氧增强蛋白(2个蛋白点)和假定蛋白(2个蛋白点)。这些蛋白质点的功能涉及到糖代谢、蛋白质降解、细胞防卫等代谢过程。     

橡胶树死皮橡胶粒子膜蛋白差异分析与初步鉴定

橡胶树死皮(tapping panel dryness,TPD)是制约天然橡胶生产的主要限制因子,在世界各橡胶种植园中普遍发生,给橡胶种植业带来严重的危害。目前仍无有效措施防治死皮发生,而橡胶树死皮发生分子机制是制定有效防治措施的前提。为阐明死皮发生的分子机制,应用双向凝胶电泳技术(2-DE),比较橡胶树死皮株与健康株橡胶粒子蛋白质组表达的差异。采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离橡胶树死皮株与健康株橡胶粒子总蛋白质,经考染显色后,用PDQuest7.40图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质。差异点经过胶内酶切和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质指纹图谱(PMF),Mascot软件搜索SWISS-PROT和NCBI nr数据库鉴定蛋白质。经过上述分析共鉴定出13个蛋白差异表达点,与健康株相比,在死皮中上调表达的蛋白质点有11个,下调表达的蛋白质点有2个,这些差异表达的蛋白质可能在橡胶树死皮发生和发展过程中发挥重要作用。     

小麦生理型和遗传型雄性不育系及其保持系小花完整叶绿体蛋白质组分比较研究

采用固相pH梯度SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术,以小麦遗传型雄性不育系ms(S)-1376、杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系ms(A)-1376,以及对应的保持系(A)-1376 (杀雄剂诱导前的正常可育系)所构建的等基因和等生理差异系为试材,比较分析了2种分离纯化完整叶绿体的方法。在确立了一套适用的技术方法的基础上,研究了三者在花粉小孢子萌发单核早期小花完整叶绿体蛋白之间的差异。采用30%、45%和60%的不连续蔗糖密度梯度离心的方法能够获得完整且纯度较高的叶绿体,经TCA-丙酮提取蛋白质后,PDQuest软件分析,在分子量14.4~66.2 kD,等电点4~7的线性范围内可分辨出2-DE图谱上239个较为清晰的蛋白质点,对其中的6个差异表达蛋白质点进行MALDI-TOF肽质量指纹图谱分析,从生物信息学数据库检索鉴定出6个差异蛋白质点分别是酰基辅酶A脱氢酶结构域蛋白、钙调结合蛋白磷酸酶、多催化功能肽酶、热休克蛋白60、光受体蛋白2及1个未知功能的表达蛋白质。这些蛋白质在供试小麦叶绿体物质能量代谢、叶绿体防卫抵御机制、叶绿体细胞内信号转导及植物极性生长等生理应答反应中起调控作用,它们能在本研究供试两不育系和对应可育系中差异表达,可能与雄性不育相关。     

玉米C型细胞质雄性不育系C48-2及其保持系线粒体差异蛋白分析

采用固相pH梯度-SDS PAGE双向电泳, 对玉米C型细胞质雄性不育系(C48-2)及其保持系(N48-2)单核期花药线粒体蛋白质进行了分离, 经考马斯亮蓝染色, 得到重复性较好的双向电泳图谱。PDQUEST软件可识别约260个蛋白质点, 对其中10个重复性比较好且差异表达在2倍以上的蛋白质点, 采用基质辅助激光解析分离飞行时间质谱进行肽指纹图谱分析, 然后用Mascot软件对NCBI数据库搜索, 其中2个蛋白质点被鉴定为谷氨酸脱氢酶(GDH)和依赖电压阴离子通道蛋白-1(VDAC1)。GDH的高表达会影响正常的氮代谢, 导致细胞的能量供应发生障碍, 有可能导致雄性不育; VDAC1是线粒体外膜上控制细胞通透性的蛋白, 与植物的程序性死亡密切相关。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS2A及其保持系的花药蛋白质组比较研究

大豆质核互作雄性不育系NJCMS2A是以栽培大豆组合（N8855 ´ N1628）F₂不育株为母本,以N1628为父本,通过连续回交选育而成的,N1628（或NJCMS2B）为其同型保持系。对NJCMS2A和NJCMS2B的二胞花粉期花药进行蛋白质组比较分析,获得重复性好的双向电泳图谱,在分子量18.4~116.0 kD、等电点4~7线性范围内,检测到约217个蛋白点,其中差异表达蛋白点25个,包括在NJCMS2A 中出现而在NJCMS2B中缺失的蛋白点13个,在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中出现的蛋白点10个,另有2个蛋白点的表达量在NJCMS2B中比在NJCMS2A中明显增强。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对差异表达蛋白进行分析,获得肽质量指纹图谱,用Mascot软件搜索NCBInr数据库,鉴定出14个差异表达蛋白,其中10个在NJCMS2A中出现而在NJCMS2B中缺失和4个在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中出现。对热激蛋白22 kD、半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶A亚基、MADS盒蛋白和淀粉分枝酶等主要差异蛋白进行功能分析,推测不育系NJCMS2A雄性不育性可能与能量代谢紊乱、细胞程序化死亡（PCD）、淀粉合成受抑制和花器官发育调节基因作用失控等有关。     

分级提取蛋白技术在蛋白质组学中的应用

以小鼠急性肝脏氧化损伤为模型,通过采用不同浓度的丙酮对小鼠肝脏蛋白进行分级提取和沉淀,用SDS-聚丙烯酰胺连续密度梯度凝胶电泳(SDS-PAGE)试验寻找差异表达蛋白质。通过试验发现,模型组中水溶性总蛋白、非水溶性总蛋白和膜蛋白总体表达量较空白组均有明显降低,进而对水溶性总蛋白进行的分级提取试验中发现有2个蛋白条带具有显著的差异性。进一步以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测差异蛋白的肽质量指纹,在蛋白质数据库中检索鉴定差异蛋白的种类,经鉴定两种差异蛋白分别为一种未命名蛋白和Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase),为进一步研究其损伤机理奠定基础。通过分级提取蛋白质样品的试验方法,降低了蛋白组学当中蛋白质分离的成本和技术难度,在保证蛋白纯度的同时提高了电泳的分辨率,电泳图中的条带清晰、分明,便于后期进行质谱分析,同时也为蛋白质组学的应用提供了一种新思路和新方法。     

盐胁迫下棉花叶片差异蛋白表达的分析

以耐盐的陆地棉品种中07为研究材料,在其生长的三叶期,用未处理和0.4%NaCl胁迫处理24h的幼苗,分别提取其叶片全蛋白。通过等电聚焦和第二向SDS-PAGE技术获得完整的棉花叶片总蛋白图,利用ImageMaste-2DElite5.0软件分析各个差异蛋白在对照和0.4%NaCl胁迫24h后棉花叶片中的相对表达量,并选取质量好、实验重复性高的10个特异的差异表达蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定。结果表明,从对照和盐胁迫处理的双向电泳图谱中共检测到24个差异蛋白质点,这些差异蛋白质点的等电点分布集中在5.0～6.5之间,分子量分布集中在40.0～110.0kD之间;进一步质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析鉴定的10个差异蛋白质点,其中4个蛋白质点获得了鉴定结果,这4个差异表达蛋白质点分别为1,5-二磷酸核酮糖羧化/氧化激酶α2(编号4)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基(编号5)、未知蛋白产物(编号19)和OEE2(编号32)。我们初步推测OEE2和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶可能与棉花耐盐胁迫特性有关。     

短季棉叶片早衰的比较蛋白质组学研究

选取短季棉品种中棉所10号为研究材料,在棉花叶片衰老过程中,分别取30 d,40 d和50 d时的叶片进行叶片全蛋白的提取,利用双向电泳技术分析叶片衰老过程中的差异蛋白。考马斯亮蓝染色、扫描得到双向电泳图谱后,利用软件ImageMaster 2D Platinum 7.0分析差异蛋白。结果表明,在这3个时期里,共有33个蛋白点表达水平显著变化;对选取的差异蛋白点进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,最终成功鉴定其中12个蛋白点。蛋白质组学分析表明衰老过程中:参与病虫害防御反应的蛋白6个显著下调表达,1个上调表达;参与光合作用的蛋白2个上调表达,1个下调表达;参与信号转导的2个蛋白均下调表达。     

青海高原耐旱蚕豆品种青海13号响应干旱胁迫蛋白质组学分析

蛋白质组学研究在功能基因组时代发挥着越来越重要的作用,利用双向电泳技术和质谱鉴定技术,可大量研究作物逆境胁迫后蛋白质组的变化,增加作物响应干旱胁迫机制的认识和理解。为探讨一种抗旱性蚕豆青海13号品种的耐旱机制,本研究对其幼苗期进行干旱胁迫处理,应用上述技术进行差异蛋白质组分析,经t检验发现32个差异表达蛋白点,部分呈现上调表达,部分呈现下调表达,还有7个消失蛋白点和1个新增蛋白点。采用MALDI-TOF/TOF鉴定和生物信息学分析发现,成功鉴定的21个蛋白点按其所参与的代谢途径和生化功能可分为七大类,参与信号转导的2个,参与自由基清除的1个,参与防卫反应的1个,参与代谢的8个,参与蛋白加工的1个,参与光合的5个,未知功能蛋白3个。22 kD干旱诱导蛋白、应激诱导蛋白、17.5 kD一级热激蛋白、超氧化物歧化酶是与抗旱性有直接关联的蛋白点,其相对表达量的上调可能是青海13号蚕豆具有较强抗旱性的重要原因。     

栽培小麦Brock和京411感染白粉菌后蛋白质组的变化

用华北地区流行的白粉菌15号生理小种,感染强抗白粉病的栽培小麦Brock和对白粉病敏感的小麦京411,通过蛋白质组技术分析其差异蛋白。结果表明,Brock经白粉菌感染12 h后,至少有6个蛋白质斑点(43 kD/pI 6.7、43 kD/pI 6.9、43 kD/pI 7.2、28 kD/pI 5.8、26 kD/pI 5.5和26 kD/pI 6.5)表达量明显增加;感染3 d后,有5个蛋白质斑点(48 kD/pI 5.6、43 kD/pI 6.9、43 kD/pI7.2、28 kD/pI5.8和26 kD/pI5.5)表达量增加;感染5 d后,有12个新的蛋白质斑点(16 kD/pI 7.6、42 kD/pI 6.5、40 kD/pI 4.8、40 kD/pI 4.6、31 kD/pI 5.7、16 kD/pI 4.6、20 kD/pI 8.3、50 kD/pI 6.7、48 kD/pI 6.6、28 kD/pI 5.7、23 kD/pI 4.8和25 kD/pI 4.7 )被诱导合成,2种蛋白质斑点(26 kD/pI 4.6和17 kD/pI 7.9)消失。京411经白粉菌感染12 h后,3个蛋白质斑点(21 kD/pI 6.4、18 kD/pI 5.4和14 kD/pI 7.0)表达量增加;感染3 d后,有2个蛋白质斑点(80 kD/pI 5.4和14 kD/pI 7.0)表达量增加,1个蛋白质斑点(16 kD/pI 5.4)表达量下降;感染5 d后,有3个蛋白质斑点(50 kD/pI 7.3、40 kD/pI 7.3和24 kD/pI 7.2)表达量增加,2个斑点(40 kD/pI 4.8和14 kD/pI 7.2)表达量下降,但没有发现新的蛋白质合成。对Brock中诱导产生的12个新蛋白质斑点,利用MALDI-TOF-MS方法,于NCBI进行数据查询,其中有6个分别属于F-box亮氨酸高度重复蛋白、重金属转运/解毒蛋白、β-1,3-葡聚糖酶(两个同工体)、β-1,3-葡聚糖酶前体、锌指蛋白。功能查询表明,上述6个蛋白参与细胞周期调控、发育、激素响应、基因转录和病害防御等。推测Brock和京411感染白粉菌后,出现的蛋白质组变化可能与各自的抗、感白粉病特性有关。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

烟草细胞质雄性不育系及其保持系的花蕾差异蛋白质分析

为探讨烟草雄性不育的分子遗传机理,对烟草细胞质雄性不育系和保持系进行差异蛋白质组学研究。采用固相pH梯度SDS-PAGE双向电泳,对烟草细胞质雄性不育系MSK326及其保持系K326雄蕊原基分化期、四分体时期及单核时期花蕾蛋白质进行分离,经考马斯亮蓝染色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。使用PDQuest软件分析蛋白质图谱,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱分析,然后用Mascot软件对NCBInr数据库搜索。在分子量14.4~97.6 kD、等电点4~7线性范围内,检测到约365个蛋白点,其中7个蛋白质点在保持系中出现, 在不育系中缺失,分别被鉴定为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、多酚氧化酶、Patatin homolog蛋白、PSI 9 kD蛋白4类蛋白,推测不育系MSK326雄性不育性可能与营养代谢紊乱、间接抑制雄性器官发育、养分供给不足、免疫能力低和能量转移受到抑制等有关。     

玉米异交不亲和基因Ga1-S的蛋白质组分析

为了研究玉米异交不亲和的蛋白表达机制,以玉米(Zea mays L.)异交不亲和基因Gal-S的一对近等基因系W22(GG)与w22(gg)为材料,组配自交(GG×GG)、正交(gg×GG)与反交(GG×gg) 3个组合。首先采用荧光显微技术, 观察比较了3个组合中花粉管在花丝中的生长过程;其次采用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,比较研究了授粉后10 h自交与反交母本W22(GG)花丝蛋白质组的特异表达差异。结果表明,授粉后10 h,自交与正交花粉管伸长可达花丝基部,而反交花丝基部未观察到花粉管;自交与反交母本W22(GG)花丝蛋白质组共检测到25个差异蛋白质点,其中15个在自交中特异表达,10个在反交中特异表达;通过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析,注释了12个蛋白质点;其中自交中特异表达的蛋白质点11、12、14和异交中特异表达的蛋白质点18、22、24可能与玉米异交不亲和密切相关。     

适用于水稻微粒体蛋白的双向电泳技术及苯达松抗性相关蛋白的初步分析

针对不同来源的样品，建立相应的双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)技术是开展蛋白质组学研究的基础。以野生型水稻(O. sativa L.)农林8号(N8)及其苯达松敏感致死(bentazon sensitive lethal, bsl)突变体农林8号m (N8m)为材料，通过优化条件，建立了适合于水稻微粒体蛋白的双向电泳技术。并通过双向电泳图谱的比对，共找到15个差异蛋白点，分为供试材料间差异、苯达松处理前后差异和N8在苯达松处理后特异表达等3种类型。结合苯达松抗性比较及苯达松残留分析，推测材料间差异是因γ射线辐照引起基因结构变异，从而影响了基因的表达；苯达松处理前后差异与氧自由基清除酶系或系统获得抗性相关酶系有关；N8在苯达松处理后特异表达与苯达松代谢有关。     

白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12S育性转换的差异蛋白质组学分析

为揭示温敏不育系PK3-12S育性转换机制,本研究以白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12花药为材料,采用2-DE和LC-MS/MS质谱鉴定等差异蛋白组学方法,分离鉴定了PK3-12在不育/可育条件下花药差异表达蛋白质,并对差异表达蛋白进行了生物信息学分析;进而采用RT-PCR检测了PK3-12在不育/可育条件下花蕾发育进程中差异蛋白编码基因表达量变化。结果表明,高温不育条件下, PK3-12花药形态瘪小,药室有少量败育花粉,育性转换受1对隐性基因控制,表达变化量在2倍以上差异蛋白质点31个,其中增量表达蛋白质点6个,减量表达蛋白质点11个,表达完全抑制蛋白点12个,不育花药特异表达蛋白点2个。质谱鉴定出15个差异蛋白质,参与信号转导通路、二羧基乙醛酸代谢、糖酵解代谢、次生合成代谢、氨基酸生物合成、分支酸生物合成、碳代谢途径等细胞过程。Rubisco亚基连接蛋白编码基因BrrbcL开放读码框(open reading frame, ORF)长度为1095 bp,编码364个氨基酸;与可育花蕾相比,发育进程中不育花蕾BrrbcL基因、膜联蛋白基因(ANN)、BetVI过敏原家族基因(BetVI)表达明显下调,表明上述基因可能参与了温敏不育系PK3-12S育性的转换。     

玉米不同组织器官谷氨酰胺合成酶同工酶表达差异及聚合方式

谷氨酰胺合成酶(GS)是作物氮同化及转移利用的关键酶,本试验研究了玉米灌浆期不同组织器官的GS同工酶表达特性,鉴定了玉米GS同工酶的聚合方式。Western blot结果表明,玉米不同组织器官的GS同工酶亚基表达存在明显差异,分子量约40 kD的GS1亚基在所有组织中均大量表达,39 kD的GS1亚基仅在穗位节及穗柄中大量表达,分子量约44 kD的GS2亚基在叶片等光合组织中微量表达。通过改进BNE技术,结合胶内转移酶活性的测定,分析了玉米GS同工酶全酶的大小;利用2-D胶结合Western blot鉴定了GS同工酶相应的亚基组成。结果表明,在玉米组织鉴定出3种分子量不同的GS同工酶,GS2全酶分子量约460 kD,为十聚体;GS1全酶有2种聚合状态,一种是分子量约410 kD的十聚体,另一种是分子量约240 kD的五聚体形式,可见玉米GS同工酶表达存在多种方式。