转Bt cry1Ah/2mG2-epsps双价基因抗虫/耐除草剂玉米研究

构建了含有Bt杀虫基因cry1Ah和耐草甘膦基因2mG2-epsps的双价植物表达载体pMAGUHM,通过基因枪轰击Q31×Z31杂交组合的胚性愈伤组织,以2mG2-epsps为筛选标记,通过1mmol/L草甘膦异丙胺盐筛选,获得T0代转化植株80株,其中PCR检测有36株为阳性植株,阳性率达45%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,证明外源基因已整合到玉米基因组中并正确表达。草甘膦及玉米螟抗性检测结果表明,有5个转基因品系表现出具有耐草甘膦和抗虫的双重特性。     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究

EPSPS (5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EC 2.5.1.19)是植物芳香族氨基酸和植物次生代谢产物生物合成中莽草酸途径的关键酶; 同时也是广谱性除草剂草甘膦的作用目标。本实验通过对草甘膦污染土壤宏基因组文库的建立及筛选, 成功克隆了一个新的草甘膦抗性的EPSPS基因(命名为soilEPSPS)。序列分析表明soilEPSPS基因全长1404 bp, 其编码的467个氨基酸中未涉及已公布专利中保护的氨基酸序列。原核功能验证表明该基因对草甘膦的耐受能力优于EPSPS CP4基因。将该基因与水稻Rubisco SSU引导肽相融合构建由actin启动子驱动的植物表达载体, 用农杆菌介导法实现了水稻的遗传转化。抗性再生植株的PCR和Southern杂交结果表明所获得的26株再生植株均为转基因阳性植株, 其中共有3个单拷贝转化事件。草甘膦抗性鉴定证明纯合体T₂代植株能够耐受高达500 mmol L^-1的草甘膦。本研究为转基因抗除草剂水稻新品种的培育奠定了基础。     

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达

本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。     

薤白EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性

葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性.将薤白中与草甘膦抗性相关的EPSP合成酶基因(EPSPsA)cDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建薤白植物表达EPSPsA重组载体,采用根癌农杆菌介导法将其转入烟草品种WS38,获得转薤白EPSPsA基因烟草.PCR分析表明,目的基因已经整合进烟草基因组中.对转基因烟草愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因烟草对草甘膦的耐受性明显提高.     

抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因表达载体构建及在玉米中的遗传转化

玉米病毒性病害和杂草严重影响其产量和品质。以pCAMBIA5300为基础载体,应用In-Fusion克隆技术构建了双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS,其中含有抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因和磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS基因,分别由玉米泛素Ubi启动子和花椰菜花叶病毒35 S启动子启动。以玉米种子黄化苗的茎尖分生组织为受体,用农杆菌介导法进行遗传转化,将抗双链RNA依赖性蛋白激酶基因PKR和抗除草剂草甘膦基因EPSPS导入玉米自交系掖478中,获得转基因植株及其子代。     

红色荧光蛋白基因DsRed2植物表达载体的构建及遗传转化

本研究通过简单检测DsRed2基因的表型就能快速筛出含有目的基因的成熟籽粒。DsRed2是一种在激发光下呈红色的荧光蛋白,根据在GenBank中获得的DsRed2及其特异性启动子Ltp2的基因序列,设计特异性引物,并构建筛选标记为Bar基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2,通过农杆菌介导法转入玉米品种郑单958中。经除草剂筛选获得210株抗性植株,PCR检测得到阳性植株80株,对PCR检测呈阳性的植株进行试纸条检测,结果表明红色荧光蛋白基因DsRed2已成功整合到玉米基因组中。通过标记基因的快速检测,从而减少后代筛选的工作量和降低制种成本,为转基因玉米新品种的筛选提供直观有效的筛选标记。     

抗玉米螟基因Cry1A.301原核表达和玉米遗传转化

增强玉米品种的抗虫性是减少玉米螟为害、提高玉米产量的有效途径。通过密码子优化改造获得抗虫基因Cry1A.301,构建原核表达载体pET30a-Cry1A.301,进行蛋白免疫学、ELISA检测以及玉米螟抗性生测。结果表明,原核表达载体中Cry1A.301蛋白高效表达,且7d后杀虫效率达100%。通过Cry1A.301基因与植物表达载体CPB连接,构建CPB-35S∶∶Cry1A.301-35S∶∶bar载体进行农杆菌介导的玉米萌动胚遗传转化,得到12株T0代转基因植株。T0代植株叶片中目的基因、筛选标记bar基因的PCR检测与蛋白免疫学检测结果表明,Cry1A.301基因已经整合到玉米基因组并表达。     

新型抗草甘膦棉花问世

<正>近日,中国农业科学院生物技术研究所的科研人员成功培育出高抗低残留抗草甘膦除草剂棉花新品系。该所科研人员将从草甘膦严重污染土壤微生物中克隆到的两个关键的抗草甘膦基因GR79EPSPS和GAT进行植物偏爱性密码子改造,构建仅含GR79EPSPS或GAT单基因和同时含有双基因的植物表达载体,而     

Bt基因转化玉米培育抗玉米螟自交系

采用基因枪法将苏云金杆菌(简称Bt)的杀虫毒蛋白基因(CryIA)导入东北春玉米自交系铁7922的幼胚中,诱导愈伤组织.抗虫基因的表达载体是pBI121,包含Bt杀虫毒蛋白基因和新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,筛选标记bar由CaMV 35S启动子驱动.通过对后代植株的除草剂草丁膦(PPT)筛选、分子鉴定和ELISA法检测,证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传.对转基因株系进行田间接玉米螟虫卵,调查不同生长时期的危害指数,最终筛选出一批抗玉米螟自交系.     

玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响

通过转基因技术将外源ppc基因导入水稻以期增加产量是国内外的重要研究领域。然而,关于ppc基因过表达能否提高转基因水稻的光合速率至今尚无定论。本研究将玉米ppc基因导入水稻中花8号,获得大量转基因水稻植株。经PCR筛选、PEPC活性测定、Southern和Western杂交分析,表明玉米ppc基因已经整合到受体水稻基因组中,并得到了正确和高效的表达。测定了温室内种植的T₁代6个PEPC活性不同的转基因水稻植株的光合速率,只有活性最高的株系的光合速率显著增加,增加的幅度为27.3%。在旱作栽培条件下测定了T₃代33个转基因株系的光合速率,结果表明在高温、高光强下,绝大多数转基因水稻的光合速率增加,最大提高了68.8%。比较6个转基因株系的T₁和T₃代看到,逆境胁迫条件下转基因水稻光合速率明显提高。以上结果表明水稻中导入ppc基因可以提高其光合速率,特别是逆境条件下的光合速率。     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

转基因抗丝黑穗病玉米的遗传、表达及选育研究

本研究以几丁质酶基因导入玉米自交系海92-1所获得的转基因植株的种子作为试验材料,对其To代种子进行了潮霉素抗性筛选试验,结果表明T1代的分离比分别为3:1和15:1(表1).这证实大多数转基因植株中几丁质酶基因是以单拷贝、单位点整合到植株的基因组中,个别转基因植株中是以单拷贝、多位点整合到转基因植株的基因组中的.农艺性状调查分析,转基因株系的株高和穗位高都高于对照植株,单株结穗数基本不变,而转基因植株的穗长值和穗粒数值均比对照植株大,穗长增加4～7 cm,穗粒数增加1%～7%.对T1,T2,T3代株系的PCR检测结果说明目的基因在转基因植株中可稳定遗传.田间抗病鉴定结果显示,转基因株系的发病率比当代对照株系明显减少2～4级,选育得到的纯合系06006和06012的发病率为0,表现出高抗病性.     

外源脱水应答转录因子CBF4基因转化玉米的获得

用PCR方法克隆了拟南芥脱水应答转录因子CBF4基因,以逆境诱导表达基因rd29A的启动子为驱动,构建了逆境诱导表达载体pBAC146。用基因枪转化法转化玉米优良自交系的幼胚和胚性愈伤组织,轰击后的愈伤组织经过筛选、分化和植株再生过程,共获得36棵转基因植株。经PCR、PCR-Southern和Southern检测表明,外源目的基因已成功整合到部分转基因玉米株系的基因组中。人工干旱处理下,抗旱生理指标测定显示,一个转基因株系的脯氨酸含量和叶绿素含量比野生型对照提高一倍,间接表明转基因株系的抗旱能力在某种程度上有所提高。     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

转Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性

天麻抗真菌蛋白Gastrodianin在体外可以抑制多种病原真菌的生长。为检验转Gastrodianin基因小麦对真菌病害的抗性,采用基因枪法将由ubiquitin启动子驱动的Gastrodianin基因导入小麦品种扬麦158和Alondra, 获得14株纯合的转基因株系。外源基因的PCR检测、染色体荧光原位杂交、半定量RT-PCR分析结果表明,外源Gastrodianin基因在转基因小麦T₅代植株中已经纯合并有不同水平的表达;赤霉病和纹枯病抗性鉴定结果显示,Gastrodianin基因的表达能抑制病原菌在转基因植株中生长,从而减轻病原菌引起的病症发展,且两种病害的减轻程度与Gastrodianin基因的表达水平正相关。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。