木薯淀粉分支酶SBEⅠ反义基因遗传转化木薯的研究

旨在获得转淀粉分支酶反义SBEI基因的‘华南木薯8号’转基因植株,为利用转基因技术改良木薯淀粉品质打下基础。在建立了木薯从胚状体子叶到完整植株的再生体系的基础上,用块根特异表达启动子Sporamin驱动的木薯淀粉分支酶SBEI反义基因,通过农杆菌介导法对‘华南木薯8号’进行遗传转化。共接种‘华南木薯8号’子叶517块,获得7株生长良好的转化再生植株,转化再生频率达到1.35%。经PCR检测,其中5株转化再生植株扩增出目的条带,初步证实木薯淀粉分支酶SBEI反义基因已整合进了‘华南木薯8号’基因组中。通过农杆菌介导法可以将淀粉分支酶SBEI反义基因导入到‘华南木薯8号’基因组中,获得了5株转基因植株。     

农杆菌介导的马铃薯试管薯遗转化体系的优化及反义class Ⅰ patatin基因的导入

用两个马铃薯栽培品种“鄂马铃薯3号”和“甘农薯2号”的试管薯为供体材料，建立了一种农杆菌介导的简单、快速和高效的遗传转化系统。在含有75mg／L卡那霉素的选择培养基上，2～3周可产生抗性芽，4～5周获得完整的转基因植株。筛选出了试管薯遗传转化的优化条件，特别是在再生培养基中加入2mg／L玉米素，两个品种的转化频率分别高达45．5％和43．9％。周期短(4～5周)、一步培养和转化频率高，使该转化体系能够广泛用于马铃薯转基因的研究。用含有反义class Ⅰ patatin基因的表达载体pBSAP转化两个品种，共获得120株卡那霉素抗性植株。PCR、PCR-Southern和Northern杂交分析证明，此反义基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中正常转录。反义基因的表达导致部分转基因植株的试管结薯株率和单株结薯数降低。结果表明，该class Ⅰ patatin基因可能参与了块茎形成的调控。     

利用番茄果实特异启动子E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究

利用"外源基因清除"技术(‘Gene-Deletor’),将外源基因从转基因金柑果实中彻底清除,可以达到用转基因作物生产出非转基因食品的目的。本研究利用引物pE8F和pE8R从樱桃番茄中克隆果实特异启动子E8,通过SalⅠ和SmaⅠ双酶切置换掉"外源基因清除"载体(pCambia-LF-polseed-FLP,简称Y-A)中的花粉、种子特异启动子PAB5,重新构造"外源基因清除"载体Y-A-E8,利用农杆菌EHA105介导转化实生态金柑,获得转化植株,并通过nptⅡ基因特异引物nptⅡ-F和nptⅡ-R PCR检测阳性转化植株。载体Y-A-E8 SalⅠ和SmaⅠ双酶切结果表明,E8启动子成功替换启动子PAB5,Y-A-E8经EHA105介导转化成功获得11株转化植株且PCR检测到6株为Y-A-E8转基因植株。研究结果可为"外源基因清除"技术在转基因金柑方面的应用提供参考。     

蓖麻子叶节遗传转化研究

利用前期构建的P450基因的RNAi植物表达载体侵染蓖麻受体材料,旨在获得转P450基因的阳性株。以蓖麻品种通蓖5号为试验材料,利用根癌农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,研究影响子叶节遗传转化的若干因素。结果表明:子叶节对Kan较为敏感,适宜筛选质量浓度为250 mg/L;外植体预培养2～3 d,侵染用农杆菌菌液OD600=0.8,侵染时间10 min,共培养3 d,可获得较高的遗传转化效率。再生植株经PCR和Southern Blot检测,证明为转基因植株。     

多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化加工番茄

利用农杆菌EHA105介导转化,将PG基因转入加工番茄B04植株。通过对影响外植体转化的因素（预培养时间、侵染时间、农杆菌浓度、共培养时间）进行了深入探讨,建立了加工番茄品种B04子叶外植体的高频遗传转化体系,并通过农杆菌介导法将PG反义基因导入加工番茄品种B04,获得PG抗性植株。其最佳预培养时间为2天;当农杆菌的菌液浓度为OD₆₀₀＝0.6、侵染时间为10 min时转化率最高;其最佳的共培养时间为2天。对获得的41株抗卡那霉素转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性植株,其转化率为22%。初步证实了部分加工番茄B04植株中已导入PG反义基因。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因遗传转化玉米自交系的研究

以玉米自交系丹黄25为试材,用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶SBEIIb基因转入玉米中,探讨了农杆菌介导玉米愈伤组织转化的影响因素.结果表明:愈伤组织经过9d的继代,菌液中乙酰丁香酮(AS)浓度为10 mg/L,侵染时间为20 min,共培养60 h为最佳转化条件.获得的4株再生植株经PCR分析鉴定,其中3株表现阳性,证...     

玉米淀粉分支酶SBEⅠ基因RNAi干扰载体的构建

淀粉分支酶(SBE)催化葡萄糖以α-(1,6)糖苷键连接,形成分支结构。SBE有3种同工酶形式：SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb,目前的研究主要集中在SBEⅡb上,而对于SBEⅠ在淀粉合成的作用报道极少。为了明确SBEⅠ在玉米淀粉合成中的作用,扩增了玉米SBEⅠ基因的337 bp片段,以pMD19-T为中间载体,pCambia3301为目标载体,构建玉米SBEⅠ基因的RNAi载体,命名为pC3301-SBEⅠ。通过限制性内切酶酶切鉴定,表明pC3301-SBEⅠ载体构建正确,可用于农杆菌介导的玉米自交系转化工作。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

苹果PGIP基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

为了验证苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因表达产物对植物病原真菌的作用,获得转基因植株,培育抗病新品种,本研究用限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ将已克隆的苹果PGIP基因从克隆载体pMD-18T上切下,定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s启动子和TNOS终止子中间,成功构建了苹果PGIP基因植物表达载体pWR306-PGIP及工程农杆菌,以番茄中蔬四号叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化,获得了8株PCR检测阳性的番茄植株.     

罗汉果遗传转化体系的建立

本研究以罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffery)子叶为外植体,通过农杆菌介导法,探讨影响罗汉果转化的几个重要因素,建立罗汉果稳定的遗传转化再生体系。结果表明:农杆菌转化前对子叶进行预培养可以促进细胞分裂,预培养的最佳时间为1d,侵染时间以为20～30min为宜,共培养最佳时间为4d,附加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)可促进转化。通过潮霉素抗性不定芽分化和抗性不定根分化的两轮筛选及PCR检测,获得56株PCR阳性植株,阳性转基因植株频率为6.86%,初步证明目的基因已经整合到罗汉果基因组中。     

半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIMEPCR分析

以甘蓝型油菜陇油2号子叶为转化受体材料,通过农杆菌介导将半夏凝集素抗虫基因(pta)导入陇油2号,经常规PCR检测获得阳性植株3株。以油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pep)作为内参基因、选pta全长序列中高度保守区域中145bp的pta2为目的片段对转基因植株进行REAL-TIMEPCR分析,初步证明外源pta基因已整合到油菜细胞基因组中。     

应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系

SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。     

转IPT基因油菜提高抗蚜虫能力

本研究利用农杆菌介导IPT(isopentenyl-transferases,异戊烯基转移酶)基因转化喀斯特特有甘蓝型油菜自交品种S65,在无激素的筛选培养基中获得再生植株14株,PCR检测12株外源基因整合入油菜基因组中.对其中5株转基因植株及5株野生型植株人工接种蚜虫试验,研究超量表达IPT基因油菜对蚜虫的抗性.结...     

木薯淀粉合成相关基因SBE和GBSS的物理定位

淀粉分支酶和颗粒结合型淀粉合成酶是木薯淀粉合成过程的关键酶。本研究利用荧光原位杂交技术对木薯淀粉合成相关的淀粉分支酶基因(SBEI)和颗粒结合型淀粉合成酶基因(GBSSⅠ,GBSSⅡ)在染色体上的位置进行了物理定位分析。结果表明:GBSSⅠ和GBSSⅡ基因分别定位于木薯华南6号的第13号染色体的短臂上和第11号染色体的短臂上,信号位点到着丝点的百分距离分别为26.3±0.1和14.0±0.5,信号检出率分别为12.9%和7.9%。而SBEI基因位于第12号染色体的长臂上,信号位点到着丝点的百分距离为76.2±0.2,信号检出率为9.4%。GBSSⅠ、GBSSⅡ和SBEⅠ基因位于不同的染色体上,互为独立基因。本研究揭示了这些基因在染色体上的分布特点和基因间的位置关系以及连锁情况,为分子辅助育种和比较基因组学研究提供理论基础。     

转Cry1A基因海岛棉的获得和鉴定

进行农杆菌介导转抗虫基因试验，以期选育抗虫性优良的海岛棉新品系(品种)；本实验在海岛棉体细胞胚再生体系的基础上，将携带Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到‘新海33号’的胚性愈伤组织中。经培养基筛选、PCR检测、RT-PCR检测、抗虫性鉴定等筛选抗虫后代。经培养基筛选共获得12棵抗性植株。PCR检测结果显示，这12棵抗性植株均能扩增出了大小相符的片段，检测结果呈阳性；RT-PCR结果显示，12棵转基因植株目的基因已经整合入基因组，且能反转录出mRNA；Bt-Cry1Ab/Ac转基因试纸条检测结果表明这12棵转基因植株含有目的蛋白；抗虫性鉴定结果证实了这些转基因植株对棉铃虫幼虫具有一定的抗性。本研究成功将抗虫基因导入至海岛棉的体内，获得了具有抗虫性的植株，其结果对转基因抗虫海岛棉新品种的培育具有一定的参考价值。     

ProDH基因反义表达载体的遗传转化

利用农杆菌介导的叶盘法将ProDH基因反义表达载体分别导入番茄品种‘耐运2000’和烟草中,建立并优化了番茄子叶再生体系。同时采用操作简单、再生周期短、转化效率较高的烟草进行了遗传转化体系的建立。试验获得49个烟草抗性芽和177个番茄抗性芽,用特异性引物对其做PCR扩增验证,共获得9个PCR呈阳性的抗性芽,其中7个烟草抗性芽、2个番茄抗性芽,因此证明外源基因已成功转入番茄的基因组中,为进一步番茄转基因工程的研究奠定基础。     

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

农杆菌介导法将热激转录因子8基因转入大豆

植物转化是开展基因工程育种和鉴定基因功能的重要途径。本研究的目的在于向大豆受体导入热激转录因子8（heat shock factor 8,hsf8)基因,以加强目的基因hsp70的表达和增加转基因大豆的抗逆性,同时探索提高大豆转化率的途径。本文以大豆子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将hsf8基因转入栽培大豆品种科新3号中,获得了13株抗卡那霉素的转化植株。PCR检测表明,其中的9株呈阳性反应,证明hsf8基因已整合到大豆基因组中。本实验获得的实际转化率为2．39％。文中讨论了选择适宜的种子灭菌方法和大豆受体品种对提高转化率的有效作用。     

转基因番茄试管内开花结实体系的建立

本研究建立了一种农杆菌介导法转化矮化型番茄Micro-Tom的试管内开花结实体系。以MS为基本培养基,附加2.0mg/L6-BA时,卡那霉素抗性再生芽的花芽诱导率为100%,在附加2.0mg/L6-BA和1mg/LGA即可诱导开花结实。经GUS组织化学染色和基因组PCR检测证实得到了转基因植株,本实验证明了该转基因植株在试管内开花结实体系从子叶共培养至转基因果实的获得最快仅需90d,为外源基因功能研究提供了一种快速方法。     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。