基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别巴戟天及其3种近缘植物

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别巴戟天及其3种近缘植物。对巴戟天及其3种近缘植物的ITS2和psbA-trnH序列进行PCR扩增和测序,运用遗传距离分析、DNA Barcoding Gap和系统发育(NJ)树3种方法对其进行鉴别。结果,巴戟天及其3种近缘植物的ITS2序列长度为237bp,GC含量为70.3%,保守率为86.08%,变异率为13.92%,ITS2序列上种间变异大于种内变异,存在较显著的DNA Barcoding Gap,其NJ树能准确鉴别出全部供试物种。巴戟天及其3种近缘植物的psbA-trnH序列长度为290bp,GC含量为20.2%,保守率为53.10%,变异率为46.55%,psbA-trnH序列上种间变异大于种内变异,无明显的DNA Barcoding Gap,其NJ树仅能准确鉴别出海滨木巴戟和羊角藤。ITS2序列的物种鉴定能力优于psbA-trnH序列。因此,基于ITS2和psbA-trnH序列能成功鉴别巴戟天及其3种近缘植物。     

从核糖体DNA ITS区序列研究甘蔗属及其近缘属种的系统发育关系

测定了甘蔗属及其近缘属的13个种共43个个体和1个橡草(Pennisetum schumach)外群的核糖体DNA中的内转录间隔区(ITS)及5.8S rDNA 基因的序列.结果表明:甘蔗属及其近缘属种的ITS区(含ITS1,5.8S rDNA和ITS2)序列的长度范围为589～591bp,变异位点为140个,信息位点为60个;其中,ITS1和ITS2的长度范围分别为205～208bp和216～220bp,     

基于ITS 2序列的15种淫羊藿属药用植物分类鉴定研究

为探讨内转录间隔区2(ITS 2)序列及其二级结构在15种淫羊藿属(Epimedium)中的鉴定效率。利用试剂盒提取叶片总DNA,对ITS 2序列进行PCR扩展与测序,计算K 2 P遗传距离,构建系统发育树,预测其二级结构。结果表明,ITS 2序列在15种淫羊藿属植物中的通用性好,扩增成功率与测序成功率均为100%。从K2P种间和种内遗传距离看,ITS 2在淫羊藿属中的种间变异较小,部分种类种内遗传距离大于种间遗传距离,鉴定成功率约为60%。采用比对法(Blast)分析,ITS 2鉴定效率为75%。由ITS 2系统进化树可知,淫羊藿属与鬼臼属各为一支,易于分开。除薄叶淫羊藿、竹山淫羊藿、巫山淫羊藿外,其余种类均能较好的进行聚类;除粗毛淫羊藿、保靖淫羊藿外其余均不能与NCBI下载到的序列进行较好聚类。研究表明,15种淫羊藿属植物ITS 2序列在ML系统进化树中具较好的鉴别能力,但淫羊藿属各样本种内与种间遗传较为混乱,遗传距离复杂,ITS 2二级结构形态结构亦较为相似,将各种间进行区分存在一定难度,不适合单独作为该属条形码使用。     

黔产党参属和金钱豹属植物分子鉴定研究

探究适宜党参属和金钱豹属药用植物分子鉴定的DNA条形码候选序列。对11个物种53份样品的psbAtrnH、rbcL、matK及ITS 2序列进行PCR扩增、测序和Barcoding gap分析,比较各序列的扩增和测序效率,种内和种间变异,并采用BLAST 1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力。结果显示,PCR扩增率均达100%,测序率除了matK外,其余的均为100%。种间变异ITS 2最大,其余依次是matK、psbA-trnH及rbcL。种内变异matK最大,其余依次是rbcL、ITS 2和psbA-trnH。Barcoding gap图表明,4条序列种内和种间遗传变异重叠比例大,无明显的Barcoding gap。BLAST 1鉴定结果表明,rbcL鉴定率最高,其余依次是matK、ITS 2和psbA-trnH;Nearest Distance显示,rbcL和ITS 2鉴定率最高,达到100%,psbA-trnH最低,为60.3%。rbcL和ITS 2可用于党参属和金钱豹属药用植物及相关药材的分子鉴定条形码,matK可作为候选条形码。     

三种蒲公英属植物DNA条形码序列的初步筛选

橡胶草(Taraxacum kok-saghyz, TKS)作为天然橡胶替代资源,具有重要应用前景,但由于两种生活力更强的近缘种短角蒲公英(T. brevicorniculatum, TB)和普通蒲公英(T. officinale, TO)的广泛共域存在,TKS种质资源的收集和未来商业种植受到严重影响。为了在分子水平上鉴定这些蒲公英物种,并研究TKS及其近缘种之间的种群分化和进化关系,本研究以10株TKS、2株TB和2株TO野生资源为材料,对3种叶绿体DNA (trnH-psbA, petL, ycf1)和1种核DNA (ITS2)序列进行初步筛选。结果显示,ITS2和trnH-psbA存在较大的种间变异,可较好的区分这3种蒲公英植物,但二者的种内变异均极小,无法用于种内种群结构研究;petL和ycf1的种间和种内遗传距离均为0或接近0,在蒲公英植物上无应用价值。此外,基于ITS2和trnH-psbA序列的系统进化树分析表明,TB可能是由TKS (母本)和TO (父本)杂交后代进化而来的。本研究为下一步橡胶草种质资源研究提供了参考依据。     

稗属植物DNA条形码研究

为评估DNA条形码在稗属植物鉴定中的有效性,选取核DNA条形码序列ITS和ETS及叶绿体DNA条形码序列psbA、trnL-F和matK作为候选序列进行了分析。本研究对无芒稗、稗、长芒稗和细叶旱稗4种稗属植物的不同DNA条形码序列进行了扩增、测序,并分析了不同候选条形码序列的特征。结果显示,matK序列变异位点占比最高(3.6%),ETS序列最低(1.7%);psbA序列种间变异最大,matK序列种内变异最大;邻接树分析显示,条形码序列ITS、ETS、psbA、trnL-F和matK均可以区分出长芒稗,支持率均大于80%;此外,ITS序列将无芒稗和稗聚于同一支,可以区分出细叶旱稗。因此,建议ITS作为鉴别稗属植物潜在的DNA条形码序列。     

基于rDNA-ITS序列探讨甘蔗近缘属种的系统进化关系

以狼尾草属(PennisetumRich.)的象草(P.purpureum)为外群体,依据rDNA-ITS序列探讨了甘蔗亚族(Saccharinae)内与甘蔗植物分类关系较近的8属37种120份材料的系统进化关系,结果表明,ITS1序列长度为200~208bp,变异位点91个,简约信息位点70个,GC含量为60.4%~69.1%;ITS2序列长度为215~220bp,变异位点93个,简约信息位点68个,GC含量为66.1%~73.4%;5.8sDNA序列长度为164bp,变异位点18个,简约信息位点9个,GC含量为54.1%~58.0%;根据变异位点,简约信息位点占总位点的比例可以看出,ITS序列比5.8sDNA序列变异程度高,其中ITS1序列又较ITS2序列变异丰富。属种间遗传距离表明芒属(Miscanthus)和荻属(Triarrhena)与甘蔗属(Saccharum)的亲缘关系最近,其次为蔗茅属(Erianthus)和河八王属(Narenga);而莠竹属(Microstegium)、大油芒属(Spodiopogon)、白茅属(Imperata)与甘蔗属亲缘关系较远。根据甘蔗近缘属种的NJ和MP系统发育关系,支持将斑茅(E.arundinaceus)归入蔗茅属,荻属归入芒属的观点;河八王属的河八王(N.porphyrocoma)与滇蔗茅(E.rockii)亲缘关系较近,而与同属的金猫尾(N.fallax)亲缘关系较远;蔗茅属和芒属属种系统进化关系较其他属种复杂;有4份材料被发现鉴定有误,不应用于后续研究。     

普通小麦rDNA的ITS区及其基因组起源

采用特异引物对普通小麦(Triticum aestivum L.) rDNA的ITS区片段进行PCR扩增并测序,通过邻接法聚类分析, 得到3种类型的扩增产物。结果表明,ITS区序列长度是602 bp,其中ITS1和ITS2分别有8个和20个变异位点,ITS区揭示的遗传分化距离变化范围为0~0.038,平均值为0.021。通过从GenBank搜索并下载普通小麦野生近缘种ITS序列与本研究获得的普通小麦ITS序列进行比对,并用MEGA、PAUP、PHYLIP软件分析,按Kimura-2参考模型计算分化距离,以旱雀麦(Bromus tectorum)为外类群邻接法构建聚类树。根据杂交后代具有亲本的ITS序列遗传特点,认为小麦形成较晚,尚未同步进化完全,从分子水平上为普通小麦是异源六倍体提供了证据。通过与其A、B、D基因组可能供体的ITS区序列进行比对分析发现各自有不同程度的变异,认为普通小麦在多倍体形成过程中发生了序列消除现象,结合我们提出的“同步进化”对于不同的基因或者说不同类型的DNA序列是不同步的假说,解释了无法找到真正供体的原因。综上所述,我们认为A、B、D基因组的原初供体可能分别是乌拉尔图小麦(T. urartu)、山羊草(T. speltoides)和节节麦(T. tauschii)。     

基于nrDNA-ITS序列的10种枸杞属植物亲缘关系研究

以10种枸杞属植物为材料,利用nrDNA-ITS序列,探讨其遗传多样性及亲缘关系。采用改进CTAB法提取枸杞叶片基因组DNA,利用合成的ITS4和ITS5为引物对其DNA中的nrDNA-ITS区进行扩增、对目的片段测序,并对测序结果进行聚类分析。测序结果表明,10种枸杞属植物ITS的长度为582~656 bp,保守位点(C)560个,变异位点(V)95个,其中简约信息位点(Pi)70个,单核苷酸变异位点(S) 25个;5.8S序列的长度均为154 bp,保守位点(C)136个,变异位点(V)18个,其中简约信息位点(Pi)12个,单核苷酸变异位点(S)6个。10条序列聚类图明显地分为2大类5个小组,‘0901’与‘蒙杞1号’处于同一分支,亲缘关系最近,‘宁杞3号’和‘宁杞7号’为同一分支,亲缘关系最近,‘宁杞5号’和青海诺木洪黑果枸杞单独为一分支,与其他几个枸杞品种的亲缘关系最远。10条枸杞属植物的ITS序列已上传至NCBI,登录号为KJ189761~KJ189770。本研究测序和分析了10种枸杞属植物的ITS序列,聚类结果表明了它们之间的亲缘关系与差异,为枸杞遗传多样性和系统发育研究奠定了基础。     

基于核苷酸序列及RNA二级结构基础的针层孔菌属(Phellinus)复合种分类学研究

利用真菌核糖体核苷酸序列信息及RNA二级结构特征对针层孔菌属(Phellinus)复合种进行分类学研究。通过分析国内外已报道的一些针层孔菌属及其近缘属真菌核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)序列、线粒体核糖体小亚基DNA(Mitochondrial small subunit ribosomal DNA, mt SSU rDNA)序列,分别构建系统进化树,并基于最小自由能原理分析RNA二级结构,结果显示松针层孔菌(Phellinus pini)不同菌株的序列差异极小,其可能并非复合种,而火木针层孔菌(Phellinus igniarius)可能包含更多的种,且这些种序列变异较大,其分类地位较复杂。     

基于ITS条形码技术分析北京云蒙山杜鹃花属遗传多样性

为从分子生物学角度综合评价国内外杜鹃花属物种系统发育关系,采用北京云蒙山地区4个迎红杜鹃亚属的迎红杜鹃和1个杜鹃亚属的照白杜鹃为供试材料进行ITS序列测定,并与从Genbank数据库中得到杜鹃花属17种不同种源的ITS序列,对22种杜鹃花亚属供试材料ITS序列在选用K2模型,采用邻接法(neighbor-joining method)和最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树,分析杜鹃花亚属中各种源的系统位置,将供试杜鹃花亚属分为2大类5小类。22种供试材料均按照所属亚属被分到了不同分支,分类结果与传统的形态学分类结果较为一致。通过ITS序列比对发现,杜鹃花属的22份供试材料序列的一致性为95.29%,说明杜鹃花属ITS序列具有较高的保守性。同时,杜鹃花属的22份供试材料ITS序列均有不同程度的变异,共有80个有效变异位点,这些变异位点可以作为杜鹃花属种源的DNA指纹特异识别位点。为探讨北京云蒙山杜鹃花属种源的分类地位提供分子证据,对系统分析云蒙山杜鹃花属野生杜鹃群落的遗传多样性以及特异种质的保护、利用和开发具有重要意义。     

不同地区多花黄精的ITS序列分析及近缘种聚类分析

为建立快速鉴定多花黄精的方法及确定其亲缘关系,本研究采用DNA条形码分析的方法,通过对28个多花黄精材料的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)片段进行扩增获得ITS序列,进行多重比对,并构建多花黄精及近缘种的系统发育分析树。结果表明:本研究共获得两种多花黄精ITS的单倍型,仅发生一个位点的突变,说明多花黄精种内保守性高,遗传稳定,并可作为多花黄精DNA条形码物种鉴定的对照序列;另外,其与穇属(Eleusine)中穇子(Eleusine coracana)物种亲缘关系最近。本研究为快速鉴定多花黄精提供了新方法,并为多花黄精的后续研究提供了依据。     

芭蕉属rDNA的ITS序列分析

为了研究芭蕉属ITS序列的变异情况和组群关联,以不同地理来源的33份芭蕉属野生种作为试材,对其ITS区进行扩增、测序和序列比对,构建NJ系统树。结果表明：芭蕉属中不同类型材料的ITS序列信息位点为108个,占总碱基数的24.43%,具有较强的系统发育信号;组群间序列比对结果分析发现澳蕉组ITS序列与其他组别相比具有非常显著的差异,特异性片段共21处;从序列上推断澳蕉组可能由M.schizocarpa与M.balbisiana(ITC0271)杂交产生;真蕉组和观赏蕉组没有确切的分类特性;ITS序列的分化上可能受到地理分布的影响;陈友鉴定的新种M.tongbiguanensi在ITS序列上与其他种可明显区分开,从分子水平上验证了新种的可能性。利用核糖体ITS序列对进一步深入研究芭蕉属植物遗传演化关系具有一定的指导意义。     

冬瓜枯萎病菌核糖体rDNA ITS区的克隆与序列分析

采用镰刀菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增冬瓜枯萎病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆和序列分析;利用Mega 4.1软件对序列及GeneBank中以葫芦科为寄主的镰刀菌不同专化型ITS序列进行聚类。冬瓜枯萎病菌ITS全长1 063 bp,其中包括18S rDNA一部分序列,5.8S rDNA,ITS1和ITS2全部序列及28S rD-NA部分序列。聚类结果将15个菌株ITS序列划分为2个类群,类群I包括4个菌株,分别为2个西瓜枯萎病菌株和2个甜瓜枯萎病菌株;类群II包括11个菌株,其中冬瓜枯萎病菌株就在该类群中,其余为甜瓜枯萎病菌株5个、西瓜枯萎病菌株3个、黄瓜枯萎病菌株、丝瓜枯萎病菌株和葫芦枯萎病菌株各1个。     

基于细胞学和DNA序列的苎麻与其野生近缘类群系统关系研究

为了了解苎麻与野生近缘种的系统学关系,更有效利用野生苎麻资源,通过细胞学观察和分子标记证据,对中国苎麻与其24个野生近缘类群进行了系统学分析。细胞学结果表明,苎麻间期核形态属于田中分类体系的前染色体型,而其野生近缘种分别属于前染色体型和分散型;苎麻和23个野生近缘物种(其中15个类群的染色体数目为首次报道)中,19个为二倍体(2n=28),而大叶苎麻组3个类群为三倍体(2n=42),1个为四倍体(2n=56),1个为五倍体(2n=70)。ITS序列和trnL-F序列分析表明,苎麻属可分成A(含A₁和A₂亚分支)、B(含B₁和B₂亚分支)和C 3个基本分支。根据分析结果本文提出苎麻属的两条演化路线: (1)前染色体型进化路线A₁→A₂,即腋球苎麻组→苎麻组;(2)分散型进化路线B→C,即腋球苎麻组→帚序苎麻组→序叶苎麻组→大叶苎麻组。     

栽培稻种内核糖体基因的ITS序列比较研究

以普通野生稻(O. rufipogon)为外类群,对栽培稻(O. sativa)籼亚种(O. sativa ssp. indica)和粳亚种(O. sativa ssp. japonica)18个材料的核糖体基因(rDNA)内转录间隔区（internal transcribed spacers, ITS）全序列进行比较分析。供试材料中有籼亚种品种(系)9个,粳亚种品种(系)6个,爪哇稻2个和陆稻1个。结果发现,栽培稻种内总变异位点23个,占总碱基数的5.41%;8个信息位点,占总碱基数的1.82%。籼亚种ITS全序列的长度为425~430 bp,G+C含量为74.25%~75.59%;粳亚种ITS序列总长度为425 bp,G+C含量为74.25%~75.59%。以ITS全序列构建的系统树能将栽培稻区分为籼、粳2个亚种群,爪哇稻与籼稻有较近的亲缘关系,这对研究栽培稻的演化有一定的指导意义。     

基于ITS基因的部分兰属序列分析

本研究以4个兰属品种为材料,通过PCR扩增及构建系统发育树,分析4个兰属品种之间的亲缘关系。结果表明:(1)4个兰属品种的ITS序列长度在647~655 bp之间,其中ITS1的序列长度为242 bp,ITS2的序列长度为244 bp。(2)四个品种共存在175 bp的变异位点,其中ITS1和ITS2的变异位点数较多,5.8S区域较为保守。(3)4个兰属品种的(G+C)含量在60.12%~68.21%之间,其中文山红柱兰的(G+C)含量最高,垂花兰的(G+C)含量最低。研究认为,ITS基因可以作为植物系统发育研究的标记,而且具有一定的灵敏度,为兰属植物的系统发育研究提供了较好的技术支持。     

甘蓝型油菜白花基因InDel连锁标记开发

碱基插入/缺失(InDel)是基因组上广泛分布的遗传变异形式。但甘蓝型油菜白花基因InDel连锁标记还未见有关研究报道。本研究以甘蓝型油菜双单倍体(doubledhaploid,DH)纯系黄花Y05和甘蓝型油菜纯系白花W01杂交构建F2群体。在F2群体中选取30株极端纯白花和30株极端纯黄花构建叶片DNA子代池,对亲本和DNA子代池进行30×重测序。以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh为参考序列, QTL-seq流程和PoPoolation2流程相互结合鉴定白花基因候选区间, 2种方法均将白花基因定位于法国甘蓝型油菜Darmor-bzh C03染色体52～54 Mb区间。利用IGV软件可视化白花基因候选区间插入缺失(InDel)变异位点,依据候选区间序列信息设计InDel引物,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选到8个与白花基因连锁共分离的InDel标记。上述研究为甘蓝型油菜白花基因精细定位和分子标记辅助选育以及白花基因功能标记开发奠定了研究基础和工作思路。     

黄花蒿中双键还原酶基因AaDBR3全长克隆与功能研究

黄花蒿中含有大量的香气类物质,在食品和医药行业有广泛的应用前景,但对其生物合成的分子机理研究非常欠缺。本研究采用SMART-RACE-PCR技术从黄花蒿花组织差异文库中获得了1个新的双键还原酶编码基因AaDBR3,其cDNA序列全长为1 279 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 038 bp编码345氨基酸,蛋白分子量为38.46 kD,等电点(p I)为6.05。通过生物信息学的分析,AaDBR3属于中链脱氢酶超级家族中leukotriene B4 dehydrogenases类酶。系统发育进化树结果表明,该基因与烟草的烯丙醇脱氢酶(NtADH,Gen Bank:BAA89423.1)的同源性最高,相似性为77%。体外酶研究发现,重组蛋白酶能催化3-壬烯-2-酮向2-壬酮的转化,表明其属于双键还原酶。本研究为进一步丰富黄花蒿优异基因资源,及黄花蒿的品种改良提供了重要的靶基因。     

基于ITS序列研究南药益智遗传多样性

海南岛益智及其姜科资源丰富,本研究基于ITS序列分析技术来研究海南岛不同居群益智及其姜科资源的遗传多样性。在海南岛内采集23份样品,其中益智样品18份,其他姜科植物样品5份,并从GenBank中获取3份山姜属植物的ITS序列作为研究系统的外群。通过软件Mega5.1比较分析了益智及其姜科植物的遗传距离和ITS序列的变异位点和信息位点,构建了NJ系统树等分析了益智种内与其姜科植物种群间的遗传多样性。研究结果表明海南岛不同居群的益智种内ITS序列无差异,未发现遗传变异位点,而姜科植物种间差异显著,表明其遗传多样性丰富。本研究为南药益智的种质资源的保护和可持续利用奠定理论基础。