棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D₅基因组数据库以AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0, 从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0, 其开放阅读框长度为843 bp, 编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达, 开花后20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用, 本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。     

玉米ZmMGT0基因过表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明,过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。     

新疆小拟南芥NPR1基因对植物系统获得性抗性的影响

旨在研究小拟南芥NPR1基因的第三内含子对基因表达的影响。克隆出带有第三内含子的小拟南芥NPR1基因,构建诱导型植物表达载体并对拟南芥进行农杆菌遗传转化,经5 mmol/L外源水杨酸12 h诱导,利用Real-time PCR技术检测拟南芥病程相关蛋白的表达量。结果显示野生型拟南芥的NPR1、PR-1、PR-2、PR-5表达量高于转基因拟南芥;相对于野生型拟南芥,转基因拟南芥中SOD、POD酶活显著降低,而CAT酶活增加未达到显著水平。结果表明转入含有第三内含子的Ap.NPR1基因,转基因植株系统获得性抗性途径受到抑制,植株抗病性降低,说明第三内含子使得系统获得性抗性途径的基因表达受到抑制。     

转GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性

以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号为试验材料,克隆到1个A亚族bZIP类转录因子基因,命名为GmAREB (Glycine max ABA responsive element binding protein)。该基因由1 317个核苷酸组成,编码439个氨基酸残基,包括4个保守的磷酸化位点区域(C1、C2、C3和C4)、1个核定位信号区(KVVE)和1个bZIP转录因子保守域。聚类分析显示GmAREB蛋白与拟南芥ABF2、水稻OsTRAB1具有较高的同源性,并存在较近的亲缘关系。采用凝胶阻滞实验方法证明GmAREB蛋白与ABRE顺式元件具有体外结合特异性。功能分析结果表明, 在干旱胁迫条件下, GmAREB转基因拟南芥的存活率(50%)显著高于野生型(5%);气孔统计分析显示转基因植株的气孔开度(0.8 μm)明显比对照开度小(2.6 μm)。氧化胁迫结果显示GmAREB转基因拟南芥在甲基紫精溶液中叶绿素含量比野生型高(7.3 mg g^–1 FW)。转基因拟南芥RT-PCR分析表明,GmAREB基因过表达能够增强下游胁迫相关基因ABI1、ABI2的表达,抑制气孔开闭相关基因KAT1、KAT2的表达。综上所述,GmAREB基因过表达有效调控了转基因拟南芥下游靶基因表达,加速了气孔关闭,减少了水分蒸发和叶绿素降解,从而提高了转基因拟南芥对干旱、氧化胁迫耐性。     

陆地棉GhCRE1影响种子萌发初探

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提...     

小黑麦TwNA C01基因功能分析

NAC是一类调控植物发育、衰老、生物与非生物逆境以及在激素反应方面具有重要作用的转录因子。为解析小黑麦TwNAC01基因的初步功能,本研究以从六倍体小黑麦中克隆到NAC转录因子基因TwNAC01为基础,构建了过表达载体pCAMBIA1300-35S-Tw NAC01,并通过蘸花法转化拟南芥,获得转基因拟南芥株系,对转基因与野生型拟南芥在干旱胁迫下的该基因表达量与相关生理指标进行了检测。结果表明,在干旱胁迫下,TwNAC01基因在拟南芥根部表达量显著高于叶部,同时在转Tw NAC01基因植株根和叶部的表达量均显著高于野生型及转空载体拟南芥。转TwNAC01基因拟南芥叶片在干旱胁迫下失水率较转空载体和野生型拟南芥降低,其电导率、H2O2和MDA含量较转空载体及野生型株系显著降低,但叶片含水量在转TwNAC01基因株系与较转空载体及野生型株系间差异不显著,而转Tw NAC01基因拟南芥根系长度分别是野生型和转空载体拟南芥根系长度的1.5倍和1.2倍,差异显著。可见Tw NAC01在拟南芥根部优势表达,其优势表达促进了根系的伸长,提高了拟南芥抗旱能力。本研究对于理解小黑麦的抗旱分子机制提供了重要依据,也为小黑麦抗旱育种奠定了分子基础。     

拟南芥CPK6在钙离子信号转导过程中的生理功能研究

为了研究拟南芥CPK6基因在钙离子信号转导过程中的生理功能,进一步明确植物适应缺钙环境的分子机制,首先对CPK6基因缺失突变体(cpk6)进行纯合鉴定,获得了2种纯合突变体:cpk6-2和cpk6-3。通过分析野生型拟南芥Col-0和cpk6突变体在Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)二价阳离子缺失培养基上的生长表型,结果发现,拟南芥cpk6突变体在缺Ca~(2+)条件下,相对野生型Col-0,表现出生长受抑制的表型。构建含有CPK6启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的转基因材料,通过GUS组织化学染色法,发现CPK6启动子在叶片生长点部位和根上有活性,并且在缺Ca~(2+)条件下,CPK6启动子在叶片中的活性明显增强。通过原子吸收光谱法,发现拟南芥野生型Col-0和cpk6突变体之间,在对照和缺Ca~(2+)条件下,总钙含量没有显著差别,表明CPK6基因不影响植物对钙的吸收和积累。利用组织化学染色法和荧光探针,结果发现,缺Ca~(2+)条件下,cpk6突变体根和叶中H2O2的积累量明显高于Col-0,表明CPK6是介导缺Ca~(2+)诱导植物积累H2O2的负调控因子。     

玉米ZmNAOD基因的克隆与功能分析

玉米籽粒发育和光周期特性是影响产量的关键因素。本文通过RT-PCR方法, 从玉米骨干自交系昌7-2籽粒的cDNA中克隆得到一个乙酰鸟氨酸脱酰酶基因, 命名为ZmNAOD。ZmNAOD的CDS (coding DNA sequence)长1344 bp, 编码447个氨基酸。qRT-PCR分析表明, ZmNAOD基因在玉米雄穗中的表达量最高, 其次是在籽粒、叶、茎、根中; 该基因在授粉后不同天数籽粒中的表达趋势为, 0~15 d快速上升, 之后迅速下降。对该基因的过表达转基因拟南芥的研究表明, ZmNAOD基因在转基因拟南芥的根中表达量最高; 经暗处理10 d后, 转基因株系根的长度显著长于野生型; 转基因拟南芥的生育期明显提前, 其粒长和千粒重显著大于野生型拟南芥。这些结果表明, ZmNAOD基因的表达可能与籽粒发育和光周期调控有关。     

拟南芥PUB10和PUB11基因抵抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株的功能分析

丁香假单胞杆菌Pseudomonas syringae pv tomato(Pst)DC3000是研究植物免疫机制的常用病原菌。为分析拟南芥E3泛素连接酶PUB10、PUB11在免疫中的功能,本研究构建了pub10/pub11双突变体。在分析拟南芥PUB10、PUB11序列相似性和进化关系的基础上,比较了pub10/pub11双突变体和Col-0对Pst DC3000的敏感性、MAPK磷酸化水平、ROS产生的影响,并检测JA信号响应途径和免疫防御相关的部分代表性基因的表达量。结果表明PUB10、PUB11氨基酸序列高度保守,pub10/pub11双突变体对Pst DC3000的侵染更敏感,侵染后叶片病原菌数目明显增多,MAPK磷酸化水平迅速下降,ROS释放量降低,JA信号响应基因(LOX3,JR2)、免疫防御负调控基因(NIMIN1,WRKY38,WRKY62,RIN4)表达量上升显著高于Col-0,而免疫防御正调控基因(AZI1,EDS1,PAD4,EDS5,FMO1,NPR1)表达量显著低于Col-0。由此推断,AtPUB10、AtPUB11在防御Pst DC3000中起正调控作用,并且存在功能冗余。研究结果为进一步探索PUB10、PUB11调控植物防御的分子作用机制和分子育种提供了依据。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

大豆GmGBP1基因参与暗形态建成反应

于2012-2013年对Gm GBP1过表达烟草植株的研究结果表明该基因在黑暗下促进植株的黄化,抑制子叶的展开、促进下胚轴的伸长。并且,Gm GBP1启动子启动GUS在转基因拟南芥中表达,GUS染色结果表明大豆Gm GBP1启动子表达受黑暗强烈诱导,综上所述,该基因可能参与大豆暗形态建成过程。     

拟南芥转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的抗性分析

环境胁迫是影响粮食产量和品质的重要因素,在内质网胁迫条件下构建植物基因调控网络有利于粮食增产。为了分析拟南芥内质网胁迫应答过程中转录因子NAC103的生物学功能,本研究利用RNAi技术筛选到NAC103低量表达植株,并利用之前发表过的NAC103过量表达植株,发现低量和过量表达NAC103的转基因植株在内质网胁迫应答中具有不同的表现型。我们统计分析了含有真叶植株、只有子叶植株和没有子叶植株的百分率,结果表明:与野生型拟南芥相比,过量表达NAC103转基因植株对内质网胁迫的耐受性更高,而低量表达NAC103转基因植物对内质网胁迫更敏感。因此,拟南芥转录因子NAC103在抵御内质网胁迫的抗性应答中具有重要作用。     

大豆GmGBPl基因参与暗形态建成反应

于2012-2013年对GmGBPl过表达烟草植株的研究结果表明该基因在黑暗下促进植株的黄化,抑制子叶的展开、促进下胚轴的伸长。并且Gm,GBP1启动子启动GUS在转基因拟南芥中表达,GUS染色结果表明大豆GmGBPl启动子表达受黑暗强烈诱导,综上所述,该基因可能参与大豆暗形态建成过程。     

蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力

Hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因Hrip1转化到拟南芥,对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明Hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。3周龄的转基因植株在250 mmol L⁻¹ NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L⁻¹ NaCl和200 mmol L⁻¹甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。说明蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。     

过表达海马齿SpSOS1基因能增强转基因拟南芥的耐盐性

细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白SOS1在植物耐盐过程中起重要作用。本研究将盐生植物海马齿中的细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白基因SpSOS1构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导的方法将SpSOS1基因转入到拟南芥中,在含有50μg/mL潮霉素B的MS培养基上筛选转基因后代,结合目标基因和标记基因的PCR验证,获得了超表达的转基因拟南芥。利用T_3代转基因幼苗进行耐盐性分析。研究表明,转SpSOS1基因的拟南芥在50 mmol/L NaCl的培养基中发芽率在80%以上,明显高于野生型拟南芥的45%。转SpSOS1基因拟南芥幼苗的耐盐性明显提高,在100 mmol/L NaCl条件下能正常生长,具有较高的生物量、根长和侧根数,而野生型拟南芥在50 mmol/L NaCl的胁迫下明显萎蔫、失绿、甚至死亡。说明过表达SpSOS1基因显著提高了拟南芥的耐盐性。     

陆地棉GhLEA3基因的克隆及其响应低温胁迫表达分析

【目的】本研究旨在探索棉花GhLEA3基因的结构特征及其在低温胁迫下的表达模式,研究其抗逆功能。【方法】利用同源序列克隆法在陆地棉中克隆GhLEA3;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质,构建系统进化树。采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白表达载体35S∷GhLEA3-GFP并进行亚细胞定位;在棉花三叶期进行叶片低温表达分析;采用农杆菌介导的花序浸染法将GhLEA3基因转入拟南芥;对T_3转基因拟南芥种子进行4℃低温萌发试验;低温处理后测转基因拟南芥叶片的电导率。【结果】GhLEA3基因编码序列全长1 218bp,编码405个氨基酸;GhLEA3蛋白含有4个功能结构域PF02987。陆地棉GhLEA3与拟南芥AtLEA3氨基酸序列之间相似性为52.6%。GhLEA3蛋白可能定位在液泡和小泡中。GhLEA3基因在低温处理的棉花叶片中上调表达。T_3转基因拟南芥低温萌发率显著高于野生型,低温处理后转基因拟南芥叶片电导率显著低于野生型。【结论】陆地棉GhLEA3属于典型的LEA3家族成员,与拟南芥AtLEA3亲缘关系最近;该基因响应低温胁迫,可能在抗冷中起重要作用。     

异源表达棉花GhPRP5基因增强了拟南芥对盐和ABA的敏感性

富含脯氨酸的蛋白(proline-rich proteins, PRPs)代表一类富含脯氨酸和羟脯氨酸的细胞壁结构蛋白质,最先在伤害诱导的胡萝卜贮藏根中被发现。越来越多的证据显示这类蛋白在应答多种生物和非生物胁迫中起作用。我们之前从棉花cDNA文库中分离了一个命名为GhPRP5的编码富含脯氨酸蛋白的基因,为研究其功能,构建了GhPRP5的过量表达载体,转化拟南芥,获得GhPRP5高表达的8个株系的纯合体。在正常培养条件下,转基因株系和野生型种子的萌发率一致,但盐胁迫和ABA处理显著抑制了转基因拟南芥株系种子的萌发。盐胁迫条件下野生型的绿苗率明显高于转基因拟南芥株系,与正常生长条件相比,ABA处理抑制转基因拟南芥主根伸长的程度更大。利用Quantitative RT-PCR技术分析几个胁迫相关标记基因的表达情况表明,盐和ABA诱导了RD29A、RD29B和KIN1的表达,但诱导水平在转基因株系和野生型中不一样,说明GhPRP5参与调控拟南芥胁迫相关标记基因的表达,但具体参与的胁迫应答信号传导途径仍需进一步研究。     

拟南芥扩张蛋白AtEXP1参与气孔运动的调控

本文以过量表达扩张蛋白AtEXP1的转基因烟草为材料，通过分析不同刺激因子作用下，AtEXP1的过量表达对烟草气孔运动的影响，研究了扩张蛋白AtEXP1是否参与气孔运动的调控作用。表皮条的生物学分析表明，AtEXP1的过量表达促进了光和K⁺诱导的气孔开放，以及Ca²⁺、ABA和黑暗诱导的气孔关闭过程，但对气孔密度影响不大；充足光照、水分供应条件下，成熟转基因烟草植株的光合与蒸腾速率均明显高于野生型。以上结果表明AtEXP1的过量表达提高了气孔对环境刺激应答的灵敏性，这可能是由于AtEXP1的过量表达改变了保卫细胞细胞壁的特性，进而参与了烟草气孔运动的调控。说明AtEXP1在气孔运动中发挥积极的调控作用。