马尾松体细胞胚胎发生相关基因PmSERK1的克隆与表达分析

体细胞胚胎发生不仅是植物微繁、种质保存的有效手段,同时也是研究高等植物胚胎发育和遗传转化的模式系统之一。本研究从马尾松未成熟合子胚诱导的胚性细胞团中成功克隆了体胚发生受体激酶基因PmSERK1。该基因全长2303bp,包含完整的开放阅读框,编码626个氨基酸,其蛋白分子量约为69kD。序列分析发现PmSERK1与其它植物的SERK基因高度同源。系统进化树重建表明,PmSERK1与已知参与体胚发生的关键SERK基因聚为一类,如MtSERK1、CuSERK1、AtSERK1和DcSERK。表达分析显示:PmSERK1在主要的组织器官(根、茎、针叶等)略有表达;但在诱导培养的非胚性愈伤中没有检测到表达,而在经继代培养的胚性愈伤中表达很高且逐渐增加,且在培养20d时达到最高。另外,在再生的子叶胚中,PmSERK1的表达量也很高。综上所述表明,PmSERK1是与体胚发生相关的关键SERK基因的直系同源基因,可以作为愈伤组织胚性的标记基因。     

大白菜LBD基因参与愈伤组织发生及植株再生初探

植物离体再生主要经历愈伤组织形成、胚状体或器官发生和不定芽产生等过程,其中愈伤组织形成是在外源生长素和相关蛋白因子的共同作用下完成的,是植物离体再生的关键环节。拟南芥LBD16、LBD17、LBD18和LBD29是促进胚性愈伤组织发生的关键转录因子。通过对37种白菜高代自交系外植体芽再生频率的统计分析,选出具有显著差异的材料,研究了大白菜愈伤组织发生过程中上述同源LBD基因的表达变化模式,初步分析了LBD基因表达对大白菜愈伤组织产生和再生频率的影响。结果显示:白菜LBD基因与拟南芥LBD基因有很高的序列同源性,共有8个上述基因的同源基因;离体培养的白菜外植体在诱导7 d时产生愈伤组织,而LBD基因在此时表达量达到最高,然后开始降低,在整个愈伤诱导过程中呈现先上升后下降的趋势;在愈伤诱导各时期中,LBD基因在高再生频率材料中的表达一般都要高于低再生材料。这些结果表明,LBD基因参与大白菜愈伤组织产生并促进离体组织植株再生的关键基因,这为从分子水平上筛选高效再生材料,建立高效遗传转化体系奠定了基础。     

不同凝固剂对陆地棉体细胞胚胎发生和植株再生的影响

以陆地棉种质系珂字312和陆地棉标准系TM-1为材料,结合优化的陆地棉体细胞培养体系,系统地研究了琼脂、Gelrite和Phytagel3种培养基凝固剂对愈伤组织的诱导、胚性愈伤的增殖、体细胞胚状体的发生和植株再生的影响。结果表明,用Phytagel作为培养基的凝固剂,可显著改善陆地棉体细胞培养过程中的褐化问题,并具有提高胚性愈伤组织增殖速度、体细胞胚胎发生和植株再生频率等作用。Gelrite虽也能改善棉花体细胞培养中的褐化问题,但因水化现象严重而影响胚性愈伤组织增殖和体细胞胚状体发生,其效果不如Phy-tagel。因此,在陆地棉体细胞培养过程中的胚性愈伤组织诱导、体细胞胚状体发生和植株再生过程中,宜用Phytagel作为培养基的凝固剂,而无菌苗培养和愈伤组织诱导仍可以选用琼脂凝固剂。     

脱落酸对棉花体细胞胚胎发生的影响

【目的】研究脱落酸(Abscisic acid, ABA)对棉花体细胞胚胎发生过程中下胚轴脱分化和再分化的影响,优化体细胞胚胎发生体系和初步解析脱落酸调控棉花体细胞胚胎发生分子机制。【方法】以棉花品种中棉所24(CCRI 24)下胚轴为外植体,设置5个ABA浓度0、0.02、0.04、0.06、0.08μmol·L^-1,分别以A0、A1、A2、A3、A4表示,添加至MSB(MS培养基+B5维生素)培养基诱导愈伤和胚性愈伤,研究ABA对棉花下胚轴初始细胞脱分化、愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导的影响。【结果】ABA促进下胚轴初始细胞脱分化;显著提高愈伤组织的脱分化率和增殖率;0.02μmol·L^-1ABA显著提高胚性愈伤分化率,0.04~0.08μmol·L^-1ABA显著降低胚性愈伤分化率。ABA处理后胚性愈伤和非胚性愈伤的增殖率均显著提高且质地受到影响。0.02~0.08μmol ABA处理下,LBD和LBD在愈伤起始期上调表达。0.02μmol·L^-1ABA处理下,在愈伤增殖早期和中期BBM、LEC1和AGL15上调表达,愈伤增殖后期FUS3、LEA、ABI3基因上调表达。【结论】脱落酸调控的棉花体细胞胚胎发生与相关标记基因的时空性表达密切相关,这些基因表达水平的增加是ABA调控愈伤和胚性愈伤分化的分子基础。     

脱落酸对棉花体细胞胚胎发生的影响

【目的】研究脱落酸(Abscisic acid, ABA)对棉花体细胞胚胎发生过程中下胚轴脱分化和再分化的影响,优化体细胞胚胎发生体系和初步解析脱落酸调控棉花体细胞胚胎发生分子机制。【方法】以棉花品种中棉所24(CCRI 24)下胚轴为外植体,设置5个ABA浓度0、0.02、0.04、0.06、0.08μmol·L~(-1),分别以A0、A1、A2、A3、A4表示,添加至MSB(MS培养基+B5维生素)培养基诱导愈伤和胚性愈伤,研究ABA对棉花下胚轴初始细胞脱分化、愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导的影响。【结果】ABA促进下胚轴初始细胞脱分化;显著提高愈伤组织的脱分化率和增殖率;0.02μmol·L~(-1)ABA显著提高胚性愈伤分化率,0.04～0.08μmol·L~(-1)ABA显著降低胚性愈伤分化率。ABA处理后胚性愈伤和非胚性愈伤的增殖率均显著提高且质地受到影响。0.02～0.08μmol ABA处理下,LBD和LBD在愈伤起始期上调表达。0.02μmol·L~(-1)ABA处理下,在愈伤增殖早期和中期BBM、LEC1和AGL15上调表达,愈伤增殖后期FUS3、LEA、ABI3基因上调表达。【结论】脱落酸调控的棉花体细胞胚胎发生与相关标记基因的时空性表达密切相关,这些基因表达水平的增加是ABA调控愈伤和胚性愈伤分化的分子基础。     

陆地棉两个同源基因GhBlind的克隆与表达分析

Blind同源基因对植物株型调控起着重要作用。本研究用同源克隆策略,在陆地棉(Gossypium hirsutum L.) 腋芽部位cDNA中克隆出2个Blind同源基因GhBlind1(GenBank登录号为HQ115643)和GhBlind2(登录号为HQ115644)。GhBlind1和GhBlind2由3个外显子和2个内含子组成,分别编码359个和262个氨基酸残基。组织特异性表达分析表明, GhBlind1在腋芽部位和茎尖分生组织部位优势表达,在根、叶、茎尖、幼嫩纤维表达,而在茎部不表达;GhBlind2在腋芽部位以及根、茎、叶片、茎尖表达,而在纤维不表达。通过重组PCR技术,构建表达载体Psuper-gus-b1和Psuper-gus-b2;应用根癌农杆菌EHA105介导转化棉花胚性愈伤组织进行瞬时表达分析。将棉花胚性愈伤组织共培养4 d后,2个表达载体转化的胚性愈伤组织中均能检测到GUS活性,但Psuper-gus-b2表达活性强于Psuper-gus-b1。对Blind同源蛋白的保守结构域比对发现,GhBlind1和GhBlind2与Blind同源蛋白的一致性分别达94%和91%。以Blind同源蛋白作为外参,结合NCBI已公开的23个棉花MYB蛋白构建系统发生树,发现GhBlind1和GhBlind2与棉花大多数MYB蛋白遗传距离较远,和Blind同源蛋白组成一个较小的分支。     

玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究

以玉米自交系CML295、CML304和18-599R的成熟胚为外植体, 结合幼胚离体培养方法, 探讨并优化了成熟胚来源的胚性愈伤组织诱导及继代培养方法。对其愈伤组织的形态和组织切片的研究结果显示, 继代过程可产生良好的Ⅱ型胚性愈伤组织。在分化培养中分别获得68.6%、75.4%和84.8%的高频再生率, 每愈伤组织块成苗数分别为2.45、2.43和2.75。利用基因枪法转化pCAMBIA1301质粒后的GUS瞬时表达效率分别为57.9%、62.5%和73.1%, 转化pCAMBIA1303质粒后检测GFP的瞬时表达效率分别为23.3%、40%和45.5%。以上3种基因型成熟胚来源的愈伤组织转化率与其对应的幼胚来源的胚性愈伤组织转化率相似。这一技术体系为玉米的遗传改良和功能基因组研究提供了重要的技术平台。     

沙地云杉胚性愈伤组织诱导

沙地云杉(Picea mongolica)是内蒙古特有的珍稀树种,种子生产受到大小年、倒春寒及重齿小蠹等虫害的严重影响,有性繁殖受到阻碍。本研究以沙地云杉成熟胚为外植体进行胚性愈伤组织诱导,对影响胚性愈伤组织诱导的调控因子进行了研究。结果表明:(1)沙地云杉成熟胚接于培养基中培养,5 d后子叶和胚根部位膨大,10 d后胚根均明显愈伤化,40 d后愈伤呈水渍状,60 d后愈伤呈白色丝状;胚性愈伤的发生始于非胚性愈伤的表面,且长成的胚性愈伤呈细胞核大、细胞排列紧密的特点;研究结果明确了沙地云杉胚性愈伤形态学和细胞学的变化过程。(2)确定了沙地云杉胚性愈伤组织诱导的最适培养基和最佳激素组合。胚性愈伤诱导培养基为LM,激素组合为2,4-D 6 mg/L、6-BA 2 mg/L和KT 0.5 mg/L最佳培养条件为暗培养,且胚性愈伤诱导率46%。沙地云杉胚性愈伤诱导的成功可为沙地云杉资源的保护、开发、利用提供了理论依据和技术保障。     

裸燕麦悬浮细胞系的建立及植株再生

对裸燕玫成熟胚进行离体培养。研究表明,基因型和不同激素组合,地成熟胚愈伤组织诱导具有重要作用。晋燕８号愈伤组织诱导率高达８５．７％,２,４－Ｄ是诱导愈伤组织必不可少的因素。采用循环培养法对愈伤组织进行改造,获得了易分散,颗粒状胚性愈伤组织,缓减了愈伤组织生活力衰退的速度。将松脆愈伤组织置于流体培养基中进行悬浮增减得到分散性。生长快的悬浮细胞系,悬浮系经分化培养获得的再生植株     

mzhy@mail.hebau.edu.cn

 以陆地棉冀无2031无菌苗下胚轴为外植体，在MS中附加激素0.1mg/L IAA+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT的培养基上诱导出愈伤组织。选择疏松愈伤组织继代到附加0.1mg/L ZT的培养基中，经2~3个月的继代培养诱导出颗粒状疏松胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在无激素、每升加2g谷氨酰胺和0.5g天门冬酰胺的胚性愈伤增殖萌发培养基上培养2个月左右，可陆续形成不同时期的体胚苗。对冀无2031不同时期的体细胞萌发后的体胚苗进行观察，发现了真叶畸形苗、子叶节生根胚、胚轴侧生根胚、腋芽丛生苗和以腋     

不同成熟度茶籽外植体诱导发生体胚的研究

为了探究不同成熟度的茶籽作为外植体诱导体细胞胚胎发生的差异,本文选择成熟度依次递增的茶籽E1、E2、E3和E4作为外植体进行培养研究,结果表明：E4外植体接种成活率最高,但是诱导体细胞胚发生率较低。E1外植体在灭菌时耗损率相对较高,而且体胚诱导发生能力并非最佳。E2和E3外植体诱导分化体细胞胚的频率以及诱导获得的二级体胚的频率都较高,E最佳,E3次之。以上结果说明E2茶籽外植体可以作为诱导体胚发生的优良材料。     

毛白杨PtAUX1超表达诱导体状胚发生

体状胚的发生由一个生长素信号级联系统控制,其发生过程需要大量的生长素,随后在去除生长素或降低生长素浓度的条件下,体状胚趋于成熟。除植物激素外,环境胁迫也是体状胚发生所必须的,激素和环境胁迫协同诱导细胞的脱分化、再分化和体状胚的发生。目前发现的参与体状胚发生的主要基因有SERK、PKL和BBM等,它们作用于体状胚的不同发育阶段。本研究中,在毛白杨35S::PtAUX1超表达植株中发现叶片表面产生大量体状胚,体状胚分散在叶片主脉及侧脉两侧或聚集在叶片边缘,其中部分体状胚可发育成成熟体状胚。将成熟体状胚取下,置于MS0培养基上进行培养,体状胚发芽并缓慢产生根。研究结果表明,PtAUX1通过建立新的生长素浓度梯度,诱导体细胞转化成胚性细胞,从而使叶片产生出体状胚。除上述基因外,PtAUX1也参与体状胚的发生,这一研究发现现尚未见报道。     

Secondary somatic embryogenesis and applications in plant breeding

Summary Secondary somatic embryogenesis is the phenomenon whereby new somatic embryos are initiated from somatic embryos. Such cultures have been described in at least 80 Gymnosperm and Angiosperm species. In the initial step (primary somatic embryogenesis) such cultures have to be started from plant explants. In general, primary somatic embryogenesis from vegetative plant explants is, indirect and mostly driven by auxin (AUX) or auxin and cytokinin (AUX/CYT) supplemented media, whereas, from zygotic embryos it is direct and driven, to a larger extent, by CYT or growth regulator free media. Primary somatic embryogenesis from floral plant explants is between these two extremes. Indirect and direct somatic embryogenesis should be seen as two extremes of one continuum: in indirect somatic embryogenesis the embryos develop up to the (pre)-globular stage and in direct somatic embryogenesis to mature stages before they are subjected to secondary embryogenesis. In general, secondary embryogenesis requires no growth regulators in species with CYT driven primary embryogenesis. Whereas, continuous exposure to growth regulators is needed in species with CYT/AUX or AUX driven primary embryogenesis.In most species somatic embryos can be converted into shoots, although the frequencies are mostly low. In general, somatic embryos induced by growth regulator free or CYT supplemented media meet more difficulties in shoot development than embryos induced by AUX supplemented media. Applications of secondary somatic embryogenesis for plant breeding are discussed.     

Genetic control of somatic embryogenesis in cotton petiole callus cultures

Summary Three commercial varieties (Acala SJ-5, Coker 312 and Paymaster 303) and three exotic accessions (T1, T25 and T169) of cotton (Gossypium hirsutum L.) were tested for ability to undergo somatic embryogenesis. Sections of split petiole were cultured on 3 media and evaluated for embryogenesis after 180 days. Embryogenic T25 and Coker 312 plants were selected and crossed in a diallel with non-embryogenic Acala SJ-5, Paymaster 303, T1 and T169 plants. F₁, F₂ and BC₁ populations were generated and tested for embryogenesis on a medium of MS salts and vitamins (1962) plus (per liter) 4.0 mg NAA, 1.0 mg Kn, 30 g glucose, 100 mg myo-inositol, 2.0 g Gelrite and 0.75 g MgCl₂. Segregation for both occurrence and magnitude of embryogenesis was observed, suggesting the action of more than one gene.     

新疆海岛棉XH16体细胞胚发生体系的优化和细胞学观察

体胚发生率低是制约海岛棉体细胞胚发生体系应用的瓶颈之一。为提高体细胞胚胎发生率,本研究以新疆海岛棉品种XH16胚性愈伤为实验材料,从植物凝胶、培养基pH值、氨基酸含量、光照强度4个方面进行海岛棉体细胞胚胎发生诱导条件的优化。结果表明,当植物凝胶的工作浓度为2.0 g/L,培养基pH值为6.5,天门冬酰胺为0.5 g/L,谷氨酰胺为1 g/L,光照强度为3000 lx时,XH16体胚诱导率最高。此外,本研究通过显微镜技术观察体胚发生不同阶段细胞组织的形态结构,初步探讨了海岛棉体胚发生机制。本研究结果为后期借助体胚发生体系进行海岛棉分子育种工作奠定了基础。     

五加科植物体细胞胚发生研究进展

为了给五加科植物体细胞胚发生体系的建立提供理论依据,推动五加科植物体细胞胚研究的开展,本研究总结了五加科植物体细胞胚发生方式、体细胞胚发生的影响因素（包括外植体类型、培养基类型、植物生长调节剂种类、渗透胁迫）、体细胞胚发生的生理生化及次生代谢的研究现状。提出今后研究重点在以下几方面：（1）进一步对五加科植物体细胞胚发生的影响因素研究。（2）利用体细胞胚发生方式对一些重要的五加科植物进行次生代谢物的提取、代谢途径基因调控等的研究。（3）对五加科体细胞胚发生机制的分子基础需进一步研究。     

In vitro somatic embryogenesis in turf-type bermudagrass: roles of abscisic acid and gibberellic acid, and occurrence of secondary somatic embryogenesis

Bermudagrass is an important warm‐season turfgrass species that is recalcitrant in regeneration in tissue culture. In a previous report, we observed that somatic embryogenesis of immature inflorescence culture was substantially improved when low levels of 2,4‐dichloro‐phenoxy acetic acid (1 mg/l) and 6‐benzylaminopurine (BAP, 0.01 mg/l) were included in the callus induction medium. The object of this study was to further improve the culture conditions to enhance somatic embryo formation and plantlet regeneration. It was shown that the abscisic acid supplement (2 or 5 mg/l) to the above callus induction medium further enhanced somatic embryogenesis in hybrid bermudagrass (Cynodon dactylon×Cynodon transvaalensis) cv. ‘Tifgreen’. The addition of gibberellic acid (0. 2 mg/l) to the BAP (1 mg/l)‐containing regeneration medium accelerated germination/regeneration of the somatic embryos. Secondary and repetitive somatic embryogenesis, which is rarely reported in monocots, was observed in common bermudagrass (Cynodon dactylon, cv. ‘Savannah’), and a full course of such a development was captured by a periodical microphotography. Scanning electron microscopy further confirmed the observation.     

Increasing embryogenesis and doubling efficiency by immediate colchicine treatment of isolated microspores in spring Brassica napus

The effect of colchicine on induction of embryogenesis andchromosome doubling during microspore culture was evaluated in twoF₁ hybrids of spring oilseed rape (Brassica napus L.). Immediatecolchicine treatment of isolated microspores with the concentrations 50 and500 mg/L for 15 h stimulated embryogenesis and produced largeamounts of healthy-looking embryos. These normal embryos germinatedwell at 24 ^°C after being transferred to solid regeneration mediumand an initial period of low temperature (2 ^°C) for 10 days, andcould directly and rapidly regenerate vigorous plants. A high doublingefficiency of 83–91% was obtained from 500 mg/L colchicinetreatment for 15 h with low frequency of polyploid and chimeric plants.The present experiment showed that a treatment duration of 30 h revealedless positive effects on embryogenesis and doubling efficiency, especially athigher colchicine concentration (1000 mg/L). Poor embryogenesis andembryo germination were observed from ordinary microspore culturewithout change of induction medium and colchicine treatment, and severalsubcultures were required for induction of secondary embryogenesis andplant regeneration.     

不同处理诱导新海16号体细胞胚胎同步化发生

【目的】旨在探索诱导海岛棉体细胞胚胎同步化发生的有效方法。【方法】以海岛棉品种新海16号的胚性愈伤组织为材料,研究了低温、饥饿和渗透处理诱导体细胞胚胎同步化发生的效果。【结果】在低温处理组中,4℃诱导时体细胞胚胎发生的数量随着低温诱导时间的延长而显著增加;10℃诱导时,不同诱导时间下各处理体细胞胚胎发生的数量差异不显著,但都显著高于对照(28℃);缺磷、缺氮、缺肌醇3种饥饿处理的体细胞胚胎的数量都随着处理时间的延长而减少;渗透处理组中,在含40 g·L-1葡萄糖的培养基上诱导7 d的效果最佳。【结论】4℃处理3 d、缺磷处理5 d、缺氮处理5 d以及40 g·L-1葡萄糖诱导7 d可以显著促进新海16号的体细胞胚胎同步化发生,其中4℃处理3 d的诱导效果最佳。     

两种常用激素组合下棉花体细胞胚胎发生过程的组织学观察

 MSB培养基添加两种常用植物激素组合，Indole-3-butyric acid (IBA) + kinetin (KT)和2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) + KT，分别命名为IK和DK处理用来诱导陆地棉体细胞胚胎发生。陆地棉品系YZ1下胚轴切段作为外植体在诱导培养基上培养4周后，继代到分化培养基上促进体细胞胚胎发生。结果表明，两种处理均有体细胞胚胎发生，其中IK处理上外植体嫁接33 d后就可见体细胞胚出现，分化率高达97.6%，大多数外植体表现为体细胞胚较胚性愈伤早出现。DK处理中体细胞胚胎发生慢，体细胞胚都是经过明显的胚性愈伤发育而来，胚性愈伤分化率明显低于IK处理，仅为28.6%。此外，IK处理中的外植体在培养过程中大部分都出现了须根，而DK处理中则没有。两种处理中出现了两种不同的体细胞胚胎发生过程，组织学观察结果表明DK和IK处理中的体细胞胚分别主要起源于初生形成层和皮层。