一株高效降解玉米赤霉烯酮的耐酸耐高温枯草芽孢杆菌的研究

为寻求更高效、实用的生物脱毒制剂,提高其应用范围,通过采集酸性、高温的温泉环境样品,筛选获得1株高效降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的细菌菌株Y-33,并对该菌株生长和降解特性进行分析。结果表明,菌株Y-33在50℃、pH值5.0条件下孵育36 h,菌液对2 μg·mL^-1 ZEN的降解率高达93.79%,对20 μg·mL^-1 ZEN的降解率也达82.40%。从形态、生理生化特性及16S rDNA序列对菌株Y-33进行分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株发酵上清液在28℃条件下对ZEN降解率为62.02%。金属离子Mn²⁺能明显增强菌株Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率达81.17%,而Zn²⁺严重抑制了Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率仅为5.42%。本研究结果为ZEN解毒菌剂的开发与应用奠定了理论基础。     

耐低温纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶活性研究

【目的】为筛选低温下高效降解纤维素的菌种资源,促进秸秆在低温条件的快速腐解。【方法】本研究利用低温稀释平板涂布法分离、刚果红定性、内切β-葡聚糖酶活力定量等分析方法进行低温纤维素降解真菌的筛选,依据菌株形态特征及rDNA-ITS序列分析鉴定菌种,探究其在不同温度下的产酶能力,并对粗酶提取物进行酶学性质的初步研究。【结果】(1)筛选到一株低温下高效产纤维素酶的真菌ZY-50,鉴定为球芽异普可尼亚菌(Metapochoniabulbillosa),目前尚无该菌产纤维素酶的报道;(2)球芽异普可尼亚菌ZY-50可在低温条件下生长并具有较强产纤维素酶能力,其内切β-葡聚糖酶活力在28℃、16℃、10℃温度下分别为76.03 U mL^-1、128.34 U mL^-1和115.67 U mL^-1,该菌在16℃下产外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的能力较稳定,最高分别为2.31 U mL^-1、2.43 U mL^-1,16℃下滤纸酶活力最高为7.89 U mL^-1;(3)...     

一株产高温蛋白酶耐热菌BY25的产酶条件与酶学性质研究

对菌株BY25的生长条件、产酶条件及其产生的蛋白酶的酶学性质进行了研究。结果发现,BY25的最高生长温度为55℃,最适生长温度为50℃,最佳产酶温度为30℃,最佳培养起始pH为8.0,最佳C源为葡萄糖,高通气量明显提高菌株产酶能力。在以上条件下培养52 h,上清液蛋白酶活力达4 170 U/ml。酶学性质研究表明：该蛋白酶为高温中性金属蛋白酶,最适反应pH为7.0,最适反应温度为55℃,具有良好的pH耐受性和较好的热稳定性;EDTA能强烈抑制酶活力,而Fe2+、Cu2+对酶活力也具有一定抑制作用。     

灰葡萄孢霉角质酶粗提液酶学特性研究

为探究灰葡萄孢霉角质酶的酶学性质以及角质酶对植物角质层的降解作用,以灰葡萄孢霉为材料,采用角质诱导的方法得到角质酶发酵液,上清液经过分离得到角质酶粗提液,采用分光光度法探究温度、pH值、金属离子及有机溶剂对角质酶活力的影响,并通过扫描电镜探究角质酶粗提液对葡萄角质层的作用。结果表明,灰葡萄孢霉角质酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为7.5,此条件下能够保持较高的热稳定性;Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活有促进作用,而Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺对酶活有抑制作用;甲醇、丙酮、异丙醇对酶活具有促进作用,乙醇、乙腈和三氯甲烷对酶活具有抑制作用;角质酶粗酶液对葡萄角质层具有明显的降解作用。本研究结果为果蔬采后病害的控制提供了理论依据。     

发酵鲭鱼中一株组胺降解菌的系统发育分析及特性研究

为筛选出具有优良组胺降解能力的细菌,并探索其在发酵食品中的应用,使用乳酸细菌(MRS)、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBDA)和2216E琼脂培养基对传统发酵鲭鱼(Scomber japonicus)中的组胺降解菌进行分离纯化,测定其生长、产酶特性及对发酵鲭鱼生物胺的降解作用。结果表明,菌株V-TB-2-5具有较高的降组胺活性,通过16S rRNA基因序列系统发育学分析结合形态特征确定为产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)。在营养肉汤培养基中,该菌的生长和产酶条件范围为20~40℃、pH值5~8、NaCl浓度0~3.5%(质量分数w/v),最适生长和产酶条件为30℃、pH值6、1.5%NaCl。酶反应的最适条件为30℃、pH值7。Mn²⁺、Mg²⁺和K⁺等金属离子对酶有激活作用,Fe³⁺或EDTA则有抑制作用。在传统发酵鲭鱼中,人工强化接种菌株V-TB-2-5与对照组相比组胺含量明显下降,组胺降解率为18.2%~40.7%;同时,接种组中亚精胺含量下降极显著,而精胺则上升。本研究为菌株V-TB-2-5在水产品加工和贮藏过程中组胺生物降解的控制提供了应用依据。     

纤维素降解真菌A25-2的分离、鉴定及其产纤维素酶的酶学特性

本研究以Avicel-刚果红选择培养基为初筛培养基,从云南哀牢山国家级自然保护区和广西猫儿山国家级自然保护区的土壤样品中分离筛选得到4200株真菌,从中筛选出透明圈与菌落直径比较大、透明程度较为清晰的12个菌株。通过液体培养发酵,测定其上清液中的羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力和Avicel酶活力,最终筛选出一株产该三种酶且其活力均最高的真菌菌株A25-2。通过对菌株A25-2形态学观察和其内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列同源性比对分析,将菌株A25-2鉴定为哈茨木霉（Hypocrea lixii）。酶活测定结果表明菌株A25-2产纤维素酶的酶活力较高,在最适作用pH4.5和最适作用温度55℃下,其羧甲基纤维素酶活力为2.26IU/mL,滤纸酶活力为0.58IU/mL,Avicel酶活力为0.39IU/mL。薄层层析实验表明A25-2具有完整的纤维素酶系统。因此,真菌A25-2可作为饲料加工等生产和纤维素酶相关研究的备选菌株。     

水稻不同源库相关基因聚合的产量效应分析

水稻产量的高低取决于源和库的大小及彼此间的协调程度。为了了解不同源库基因聚合后对产量及其相关性状的影响,本研究以4个已克隆的水稻源库基因NAL1^LT、GNP1^TQ、Ghd7^MH63和Ghd8⁹³¹¹构建的不同遗传背景的近等基因系为材料,彼此杂交培育不同源库基因的F₂分离群体,标记辅助筛选遗传背景近似的不同单基因及双基因纯合聚合单株,考察其F₃家系的源、库及产量相关性状。结果表明,不同基因聚合的产量效应差异较大,其中NAL1 ^LT +Ghd7 ^MH63、NAL1 ^LT +Ghd8⁹³¹¹和Ghd7 ^MH63+Ghd8⁹³¹¹这3种基因聚合方式表现出较明显的增产效应,聚合系的单株产量分别比高值亲本显著增加26.45%、45.47%和48.03%,表明这3种基因聚合对聚合系的产量性状具有正向协同作用。相反,另外3种聚合方式(NAL1 ^LT +GNP1 ^TQ、GNP1 ^TQ +Ghd7 ^MH63和GNP1 ^TQ +Ghd8⁹³¹¹)的聚合系的产量相关性状有增有减或基本与双亲持平,产量聚合效应不明显。研究认为,复杂性状的聚合育种必须首先开展基因间的产量聚合效应研究,明确不同基因的聚合效果,以确保聚合育种的事半功倍。本研究结果为分子聚合改良水稻源库性状提供了理论依据。     

普鲁兰酶产生菌的诱变选育及其发酵工艺的优化

为了提高普鲁兰酶产酶酶活,以GX-6为出发菌株,采用低能离子束修饰技术对其进行诱变,并通过响应面法优化其发酵培养基。结果表明,最佳离子束诱变参数为:注入能量10 keV、诱变剂量1×10¹⁵ ions·cm^-2、诱变时间38 s,此条件下菌株正突变率比负突变率高,利用离子束诱变技术反复诱变,最终获得一株普鲁兰酶酶活较高且遗传性稳定的突变菌株GX-6-2,其酶活为2.13 U·mL^-1,较出发菌株酶活(0.65 U·mL^-1)提高了2.28倍。由Plackett-Burmen试验分析得到影响普鲁兰酶酶活的3个显著因素分别是玉米淀粉、麦芽糖和吐温-80。通过响应面试验得到最佳发酵培养参数为:玉米淀粉56.5 g·L^-1、麦芽糖11.5 g·L^-1、吐温-80 1.0 mL·L^-1、黄豆饼粉 25 g·L^-1、pH值7.0、发酵温度37℃、接种量3%、发酵时间24 h、装液量50 mL、转速180 r·min^-1,此条件下诱变菌株的酶活为2.57 U·mL^-1,较出发菌株酶活提高了2.95倍。对突变菌株的发酵特性进行初步研究发现,发酵培养24 h时,突变菌株酶活达到2.67 U·mL^-1,较出发菌株提高了3.11倍。本研究结果为利用低能离子束修饰技术诱变选育普鲁兰酶产生菌提供了一定的理论参考。     

纤维素降解菌CMC-4的分离鉴定、诱变和酶学特性研究

从秸秆还田土壤中初筛获得一株高效纤维素降解菌CMC-4,根据菌株形态、理化性质及16S rDNA序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以此为出发菌株,经亚硝酸钠诱变获得一株稳定高产纤维素酶突变株CMC-4-3。对CMC-4和CMC-4-3的产酶条件和酶学性质进行比较分析,结果表明:CMC-4-3纤维素酶活力较CMC-4提高67.5%;其最适产酶条件是:37℃、pH 6.0、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量2.0%、装液量60 ml/250 ml。该菌株所产纤维素酶的最适反应pH为6.0,且在4.0~7.0酶活力较稳定;最适反应温度为50℃,在20~80℃范围内均保持稳定;金属离子Fe~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、K~+对酶有激活作用,其余离子均有不同程度抑制作用,而Cu~(2+)和Ca~(2+)抑制作用最强,酶活力减弱近50%,是该酶的强效抑制因子。诱变前后菌株产酶条件和酶学性质等部分表型发生了变化,而突变菌株显示出了更宽泛的环境适应范围。据此,获得一株高效产纤维素酶、耐受范围广的具纤维素降解能力的地衣芽孢杆菌,而CMC-4-3和CMC-4的表型可作为深入探讨基因型变化的线索。     

秸秆纤维素降解真菌QSH3-3的筛选及其特性研究

为了获得高效降解秸秆纤维素的微生物菌株,采用滤纸降解法和刚果红染色法从含纤维素类物质的土壤中筛选到一株产纤维素酶菌株QSH3-3,通过形态观察和ITS序列分析,鉴定为草酸青霉Penicillium oxalicum QSH3-3。摇瓶产酶试验结果表明,该菌株的最佳产酶条件为:碳源为0.5%的碱处理过的玉米秸秆粉,氮源为0.2% 硫酸铵,起始pH为7,接种量为5%,产酶温度为30℃,培养时间为4 d。最佳产酶条件下,滤纸酶（FPase）、内切酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）分别为12 U、33 U、605 U（U为酶活性单位）;在15℃,其残余酶活力可达70%～80%;在pH 4～9 范围内,其残余酶活力可达70%以上。酶学稳定性研究表明,FPase、CMCase和Xylanase在pH 4～9范围残余酶活力达85%以上,具有较强的酸碱适应能力;FPase、CMCase和Xylanase在45℃以上酶活力迅速下降,耐热性较差。该菌株具有较高的木聚糖酶活力以及较强的低温、pH的耐受力,因而该菌株在田间温差大、土壤偏碱性等复杂条件下对秸秆纤维素类物质的降解具有较高的应用潜力。     

重重金属离子与简育湿润淋溶土和铁质湿润淋溶土间的结合能和吸附能

Gibbs free binding energy and adsorption energy between cations and charged soil particles were used to evaluate the interactions between ions and soil particles. The distribution of Gibbs free adsorption energies could not be determined experimentally before the development of Wien effect measurements in dilute soil suspensions. In the current study, energy relationships between heavy metal ions and particles of Hapli-Udic Argosol （Alfisol） and Ferri-Udic Argosol were inferred from Wien effect measurements in dilute suspensions of homoionic soil particles （〈 2 μm） of the two soils, which were saturated with ions of five heavy metals, in deionized water. The mean Gibbs free binding energies of the heavy metal ions with Hapli-Udic Argosol and Ferri-Udic Argosol particles diminished in the order of Pb^2＋ 〉 Cd^2＋ 〉 Cu^2＋ 〉 Zn^2＋ 〉 Cr^3＋, where the range of binding energies for Hapli-Udic Argosol （7.25-9.32 kJ mol^-1） was similar to that for Ferri-Udic Argosol （7.43-9.35 kJ mol^-1）. The electrical field-dependent mean Gibbs free adsorption energies of these heavy metal ions for Hapli-Udic Argosol and for Ferri-Udic Argosol descended in the order： Cu^2＋ 〉 Cd2^＋ 〉 Pb^2＋ 〉 Zn^2＋ 〉 Cr^3＋, and Cd^2＋ 〉 Cu^2＋ 〉 Pb^2＋ 〉 Zn^2＋ 〉 Cr^3＋, respectively. The mean Gibbs free adsorption energies of Cu^2＋, Zn^2＋, Cd^2＋, Pb^2＋, and Cr^3＋ at a field strength of 200 kV cm^-1, for example, were in the range of 0.8-3.2 kJ mo1^-1 for the two soils.     

硒处理对薄壳山核桃幼苗生长的影响

为探究硒对薄壳山核桃幼苗生长的影响,利用不同浓度亚硒酸钠[0(CK)、0.5、5、10、20、40、80 μmol·L^-1]对薄壳山核桃幼苗进行处理,并测定相关生理指标。结果表明,低浓度硒对薄壳山核桃幼苗生长发育、生物量积累、酶活性均有促进作用,而高浓度硒抑制了幼苗生长、干物质的积累、酶活性、光合速率,且硒浓度越高,抑制作用越明显。80 μmol·L^-1 硒浓度处理后的根长较CK显著降低了55.36%(P<0.05),其他形态指标均无显著差异。硒处理显著提高了幼苗体内的硒含量,且根系>叶片。随着硒浓度的增加,叶、根内的硒含量呈先升高后降低的趋势,硒浓度≥0.5 μmol·L^-1时,其他处理均与CK存在显著差异。40 μmol·L^-1硒浓度处理下叶中的硒含量较CK显著增加了1 682倍,根中的硒含量提高了482倍。低硒浓度(≤10 μmol·L^-1)处理可以促进根中Mn²⁺、Mg²⁺含量和叶中的Zn²⁺含量的积累。当硒浓度≥5 μmol·L^-1时,会促进根中Zn²⁺含量的积累,硒浓度≥10 μmol·L^-1,促进茎中Mn²⁺含量的积累,其中在80 μmol·L^-1硒浓度处理下茎中Mn²⁺含量为CK的9.29倍。过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性随着硒浓度增加均呈先增后减的趋势,且在0.5 μmol·L^-1硒浓度处理下达到最高,明显高于CK,分别为1 698.63、1 912.28 U·mg prot^-1。综上,低浓度硒处理和施硒时间长短对幼苗光合作用影响不大,而高浓度硒处理会抑制光合作用。本研究结果为进一步揭示硒富集机理和硒的科学使用提供了理论依据。     

适量供锌明显提高平邑甜茶幼苗碳氮吸收和同化效率

  【目的】  氮素利用率低严重制约我国果树产业的可持续发展。通过研究不同供锌水平对苹果砧木平邑甜茶幼苗生长、光合作用、13C同化与分配和15N吸收、利用与分配的影响,探究锌对苹果氮素吸收利用的影响机制,为苹果生产中氮肥利用率的提高提供理论参考。  【方法】  以苹果砧木平邑甜茶幼苗为试材进行砂培试验,试验周期为30天。设置Zn0、Zn2、Zn4、Zn8、Zn16 (分别相当于0、2.0、4.0、8.0、16.0 μmol/L Zn2+) 5个锌浓度处理,每3天更换一次营养液,每次向营养液中加入Ca (15NO₃)₂ 0.01 g,共计加入0.1 g。正式处理25天后进行13C标记,于13C标记后24 、48 和96 h取样,测定各器官13C丰度。另于正式处理第30天取样,测定幼苗各器官生物量、根系形态、光合特性、碳氮代谢相关酶活性、各器官锌含量以及各器官含氮量、15N丰度。  【结果】  5个处理中,Zn4处理幼苗各器官生物量与根系活力最高,根系形态指标 (根系长度、根系总表面积与根尖数) 最优。叶片净光合速率 (P_n)、气孔导度 (g_s)、PSⅡ最大光化学效率 (F_v/F_m)、二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)、硝酸还原酶(NR)及蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性随供锌水平的提高呈先升高后降低的趋势,均在Zn4处理下达到最大,其值分别为15.21 μmol/(m2·s)、184.12 μmol/(m2·s)、0.839、8.4 μmol/(g·min)、103.25 μg/(g·h)和96.6 mg/(g·h);在Zn0处理最低,其值仅为Zn4处理的0.65、0.71、0.92、0.51、0.60和0.52倍。各器官锌含量均表现为Zn16 > Zn8> Zn4 > Zn2 > Zn0。同位素示踪结果表明,随着供锌水平的提高,幼苗整株13C积累量、15N吸收量以及15N利用率表现为先升高后降低,均在Zn4处理下达到最高,其值分别为1.95 mg、0.57 mg和15.8%。不同供锌水平对幼苗13C与15N分配率也有一定影响。其中,Zn4处理下根系13C分配率与叶15N分配率最高,分别为Zn0处理的1.53和1.18倍。  【结论】  供锌不足与过量均抑制幼苗对氮素的吸收利用。而适宜供锌一方面通过改善叶片的光合作用,提高了叶片碳代谢相关酶活性,加强了叶片对碳的固定;提高了根系对光合产物的竞争力,加强了叶片光合同化物向根系的运输,促进根系生长发育的同时,改善了根系形态,提高了根系活力,进而增强了幼苗对氮素的吸收。另一方面,促进了氮素由根系向叶片的运输,同时提高了叶片硝酸还原酶活性,提高了幼苗对氮素的同化利用能力,进而促进了幼苗对氮素的吸收。因此,适宜锌营养可以有效提高幼苗的碳、氮吸收和同化效率。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达

玉米赤霉烯酮(ZEN)是具有雌激素作用的次生代谢产物,可以被来源于Gliocladium roseum的内酯水解酶降解为无毒物质。为了实现玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达,获得不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,本研究采用一步克隆及重叠延伸PCR的方法构建了单启动子和包含Hpa Ⅱ和P43双启动子的表达质粒,将质粒转化到枯草芽孢杆菌中,获得重组菌株168/pMA5-zlhy-6和168/pMA5-P43-zlhy。然后构建了重组整合载体amy-p43-zlhy,将zlhy-6基因整合到枯草芽孢杆菌168的基因组中。通过Cre/lox系统敲除抗生素抗性基因,获得整合了P43-zlhy表达盒的食品级重组枯草芽孢杆菌BZ-zlhy。将构建的3个重组菌株在37℃、pH值7.5条件下培养36 h,结果显示,双启动子表达载体重组菌株的最高酶活性为2.2 U·mL^-1,是单启动子菌株的1.2倍。双启动子重组菌株表达的降解酶对ZEN(4 μg·mL ^-1,30 min)的降解率为65.1%。重组菌株枯草芽孢杆菌BZ-zlhy表达水平最低(0.4 U·mL^-1)。本研究实现了玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中表达,同时构建了不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产奠定了基础,也为解决粮食储藏和饲料生产中的ZEN污染提供了思路。     

Protective role of proline against salt stress is partially related to the improvement of water status and peroxidase enzyme activity in cucumber

A salt-sensitive cucumber cultivar "Jinchun No. 2" ( Cucumis sativus L.) was used to investigate the role of proline in alleviating salt stress in cucumber. Proline was applied twice (day 0 and day 4 after salt treatment) as a foliar spray, with a volume of 25 mL per plant at each time. Plant dry weight, leaf relative water content, proline, malondialdehyde (MDA), Na⁺, K⁺ and Cl⁻ contents, as well as superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) activities in the plants were determined at day 8 after salt treatment. The results showed that 100 mmol L^–1 NaCl stress significantly decreased plant dry weight, leaf relative water and K⁺ contents, and increased leaf MDA, Na⁺ and Cl⁻ contents and SOD, POD, CAT and APX activities. However, leaf proline accumulation was not affected by salinity. The exogenous application of proline significantly alleviated the growth inhibition of plants induced by NaCl, and was accompanied by higher leaf relative water content and POD activity, higher proline and Cl⁻ contents, and lower MDA content and SOD activity. However, there was no significant difference in Na⁺ and K⁺ contents or in CAT and APX activities between proline-treated and untreated plants under salt stress. Taken together, these results suggested that the foliar application of proline was an effective way to improve the salt tolerance of cucumber. The enhanced salt tolerance could be partially attributed to the improved water status and peroxidase enzyme activity in the leaf.     

隔盐方式对设施盐渍化土壤主要盐离子空间分布及酶活性的影响

针对设施土壤盐渍化日趋加重的现状,采用土柱模拟试验,以无隔盐层为对照,设置了3种隔盐层类型:砂砾层（T₁）,复合有机物料层（T₂）、砂砾+复合有机物料层（T₃）,探索不同隔盐模式的抑盐效果。结果表明:盐离子含量随着土层深度的增加而逐渐降低;就7种主要离子（Na⁺,NH₄⁺,K⁺,Ca²⁺,Cl^-,NO₃^-,SO₄^2-）总含量而言,T₃在0-10 cm,10-20 cm和20-30 cm时分别较CK降低了13.5%,0.61%和27.0%,效果较好;T₁和T₂隔盐效果不明显。0-30 cm土层,T₃分别增加了脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性达7.30%,4.70%,3.58%,降低了过氧化氢酶活性达8.53%;而T₁则趋势相反。说明T₃可以较好地抑制设施盐渍化土壤盐离子在耕层的聚集,同时可以提高土壤酶活性,对改善设施盐渍化土壤质量具有一定的作用。