水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆＣ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆到一个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。本研究对水稻白叶枯病菌的这一基因的ＤＮＡ序列进行了测定分析，结果表明，它与甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ基因具有高度的同源性。因此，将水稻白叶枯病菌的这一基因也称为ｒｐｆＣ基因     

水稻细菌性条斑病菌REC结构域蛋白基因vemRXoc的功能鉴定

水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）是水稻的主要病原细菌之一,该菌引起的水稻细菌性条斑病可导致水稻减产、品质下降。Xoc GX01菌株基因组中含有一个与十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）的致病相关基因vemR一致性高达95.27%的同源基因XOC2152,其编码蛋白中含有磷酸信号识别受体REC结构域。为了研究XOC2152基因在Xoc中的生物学功能,本研究通过基于自杀质粒pK18mob同源整合方法,构建了XOC2152的非极性突变体NK2152。该突变体的胞外多糖产量仅为野生菌株的27.33%,平板游动半径为野生菌株的40.96%,对铜离子耐受能力极显著降低。针刺接种水稻（日本晴品种）10d后,Xoc GX01处理的病斑平均长度为（3.86±1.19）cm,而突变体NK2152处理的病斑长度为（0.98±0.45）cm。带有该基因片段的pLAFR3可以互补突变体的表型和致病力变化。上述结果表明XOC2152基因具有与Xcc的vemR类似的功能,被命名为vemRXoc基因。本研究表明XOC2152基因（vemRXoc基因）与水稻细菌性条斑病菌的致病力、胞外多糖产量、运动能力以及对铜离子的耐性等相关。     

水稻9311及其突变体响应白叶枯病菌的活性氧变化

为筛选水稻白叶枯病敏感型突变体材料,并确定其与白叶枯病菌互作早期活性氧代谢规律及其与抗病性的关系,用11个白叶枯病菌小种于分蘖期对野生型9311及其10个辐射突变体进行抗性评价,以接种后的病斑长度为依据,聚类分析发现突变体189抗病性与野生型差异最大,进而以突变体189为材料,比较研究接种P6小种后的活性氧变化。结果显示:接种后24 h,9311的O2·-和H2O2释放量达峰值,分别为突变体的120%和134%,差异达极显著水平;P6菌在189和9311叶中的生长趋势基本相同。推测9311可能是因高积累的活性氧分子抑制了白叶枯病菌在叶片中的扩展,从而限制了病斑长度。     

水稻白叶枯病黄单胞菌编码顺乌头酸酶的rpfA基因的鉴定

通过生化功能分析，证实了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株Ｔ３０００产生两种顺乌头酸酶（分别命名为ＸｏｏＡｃａｎＡ和ＸｏｏＡｃａｎＢ）。通过三亲本接合的方法，将获得的含水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆ基因簇的重组质粒ｐＧＸＮ３０００导入甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因突变体８４７６中。经生化功能分析证实，８４７６／ｐＧＸＮ３０００中含有水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶ＸｏｏＡｃａｎＡ；同时还证实了ＰＧＸＮ３０００能互补８４７６，恢复其合成胞外酶和胞外多糖的能力及致病性．这表明在ＰＧＸＮ３０００中含有一个完整的水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶基因，该基因具有类似甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因的功能．因此将该基因命名为水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因。     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。     

水稻白叶枯病黄单胞菌中与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病因子调控基因(rpf 基因)同源基因的分子克隆

DNA-DNA 杂交结果表明,水稻白叶枯病黄单胞菌总 DNA 中存在着与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病因子调控基因(rpf 基因)具有同源性的 DNA 外段.应用广谱性寄主载体pLAFRI,在大肠杆菌中建立了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株 T3000的基因文库.从文库中筛选到与 rpf 基因具有同源性的克隆 pGXN3000,将重组质粒 pGXN3000通过三亲本接合转入甘蓝黑腐病黄单胞菌 rpf 基因突变体,发现 pGXN3000能互补甘蓝黑腐病黄单胞菌 rpf突变体,恢复其致病性胞外酶和胞外多糖的产生及致病性.转座子 Tn5诱变,缺失分析及DNA-DNA 杂交实验结果表明,重组质粒 pGXN3000中确实含有与甘蓝黑腐病黄单胞菌编码。双组份调控系统”蛋白的 rpfC 基因功能相同的基因,此基因被定位于 pGXN3000中的3kb BamHl 片段中。     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

携带不同抗白叶枯病基因的水稻防卫基因pal和chs的转录特征

用水稻抗白叶枯病基因近等基因系材料和转基因系材料,研究了水稻－白叶枯病菌互作中,水稻防卫基因ｐａｌ与ｃｈｓ的转录特征。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ检测结果显示,在与白叶枯病菌非亲和性互作中,水稻ｐａｌ基因和ｃｈｓ基因的转录均受到白叶枯病菌的诱导;而亲和性互作中,水稻中这两种基因的转录均不受到诱导或只是受到很微弱的诱导。表明由ｐａｌ和ＣＨＳ调控的苯丙烷核心反应的启动,产物的合成,有助于增强水稻对白叶枯病菌的抗性     

水稻细条斑病菌的化学诱变及hrp基因突变体的功能互补研究

硫酸二乙酯（ＤＥＳ）化学诱变水稻细条斑病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）ＲＳ１０５获得６株ｈｒｐ突变体,其在寄主水妥上失去致病性和在非寄主烟草上失去激发过敏反应（ｈｒｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ,ＨＲ）的能力。将水稻白叶枯病菌（Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）日本系统Ⅲ号小种（ＪＯＸⅢ）基因文库和ＲＳ１０５基因文库互补ＲＳ１０５ｈｒｐ突变体Ｍ５５,     

野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ED、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ED途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ED途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因eda进行诱变,构建非极性突变体。通过对突变体表型进行分析,发现eda基因的突变体在培养基中能够正常生长繁殖,但其胞外多糖产量则降低77．6％。用一段包含eda基因的DNA片段对突变体进行功能互补,能基本恢复胞外多糖产量。这表明eda基因对细胞合成胞外多糖有重要影响,也暗示ED途径对细胞生长是非必要的,而对细胞大量合成胞外多糖是必须的。     

水稻白叶枯病黄单胞菌rpfF基因的定位及其在致病调控中的作用

检测到水稻白叶枯病菌能产生一种“跨菌调控因子”，在固体平板上，这种因子由白叶枯病菌分泌到细胞外后可以扩散并进入甘蓝黑腐病菌，调控甘蓝黑腐病菌致病因子的表达．本研究从水稻白叶枯病菌中克隆鉴定了一个与这种“跨菌”调控因子合成有关的基因ｒｐｆＦ，通过转座子诱变和标记置换（ｍａｒｋｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）技术，构建了ｒＰｆＦ突变体，突变体丧失了产生这种“跨菌”调控因子的能力，在水稻植株上的致病能力明显减弱，ＤＮＡ序列分析得知ｒｐｆＦ基因编码的产物和大肠杆菌的３－酮脂酰－ＣＯＡ硫解酶（３－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣＯＡｔｈｉｏｌａｓｅ）同源。     

利用酵母双杂法鉴定水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物寄主靶标初探

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。前期研究发现Xoo PXO99A中一个编码Ⅲ型效应物的PXO_03420（hpaF）基因与病菌游动性、致病性和致敏性有关,为探讨hpaF基因编码产物在病菌与日本晴水稻中的互作关系,本研究采用Matchmaker酵母双杂交系统构建了日本晴水稻叶片高质量cDNA文库,文库重组率为87.6%,滴度为2.57×10^6pfu/mL。将文库与构建的Y187/pGBKT7_03420诱饵进行酵母双杂交,共得到26个阳性克隆。通过对阳性克隆测序所得结果进行结构域分析,初步鉴定HpaF与水稻叶片中具有WHY或PRK结构域的两个蛋白存在互作关系。本研究结果为进一步研究hpaF基因的功能奠定了基础。     

转拟南芥NPR1基因桂99 T3代植株的抗病性及农艺性状表现

以转拟南芥AtNPR1基因的恢复系品种桂99T3代纯合株系为材料,考查其农艺性状及其抗病性,并比较转基因植株与桂99侵染水稻白叶枯病菌后的农艺性状。结果表明：转基因植株表现出对水稻白叶枯病的抗性显著增强77%以上;穗长、剑叶长、有效穗数、一次枝梗数、每穗实粒数、单株产量和谷粒宽等农艺性状与未转基因桂99无显著差别。在受到水稻白叶枯病菌侵染后,转基因植株的一次枝梗数、每穗粒数、每穗实粒数和单株产量等方面均比对照桂99高出13%～78%。说明AtNPR1基因增强了水稻的抗病能力,从而降低了病害引起的产量损失。转基因植株的恢复力不受影响,稻米品质比桂99更加优良。本工作为转基因水稻抗病育种的研究奠定了基础。     

采用两种突变方法对甘蓝黑腐病菌XC_1348基因的功能解析

为研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004基因组中一个功能未知的假定蛋白XC_1348的基因功能,本研究用自杀质粒pK18mob和pK18mobSacB分别通过同源单交换和同源双交换构建XC_1348的非极性整合突变体1348nk和有标记的缺失突变体DM1348Gm,并对两种突变体的表型进行检测,结果显示该基因突变后不影响细菌的胞外多糖（EPS）产量、胞外酶活性以及细菌游动性.有趣的是该基因的两种突变体的致病力存在较大差异,原因可能是Xcc经两种方法定点突变后分别具有的不同基因组结构而影响到某些基因的表达所致.通过研究初步了解了XC_1348基因的功能并为今后改进定点突变方法提供现实依据.     

水稻白叶枯病黄单胞菌赖氨酰－tRNA合成酶基因的定位、克隆及分析

以３２Ｐ标记的甘蓝黑腐病黄单胞菌赖氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因为探针，将水稻白叶枯病黄单胞菌同功的基因定位于ｐＧＸＮ３０００１．６ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段上．通过ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，标记置换等方法初步证实：在稻白叶枯病黄单胞菌中只有一个拷贝的赖氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因，该基因失活对病菌是致死的。