菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

菌寄生真菌的几丁质酶有很强的降解几丁质能力,在控制植物病害方面起着重要的作用.为克隆和研究菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因(tfchi1),本研究根据真菌几丁质酶基因的保守序列设计扩增基因中间片段的简并引物,采用RT-PCR、3'-RACE及5+-TAIL的方法获得了该基因的DNA和mRNA序列(GenBank:GU361769,GU361770).tfchi1长为2 561 bp,具有6个内含子,长度分别为129、78、68、65、53和59 bp,包含1 194bp的ORF,编码一个由397个氨基酸组成的蛋白.推导的tfchi1氨基酸序列以及蛋白质结构生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,与柄篮状菌(Talaromyces stipitatus ATCC 10500)几丁质酶(XP_002480365)氨基酸序列同源性为96％,分子量为43.47kD,等电点为4.97.该蛋白无信号肽序列,有15个潜在的N-糖基化位点,Tfchi1的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构.tfchi1转化毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115,酵母工程菌可分泌具几丁质酶活性的表达产物,重组蛋白的分子量与理论值相符.结果说明,本研究已从T.flavus中正确克隆了1个糖苷水解酶18家族几丁质酶基因.     

昆虫几丁质酶的分类、功能分析、重组表达及酶学性质的研究进展

昆虫几丁质酶及其类似蛋白在昆虫生长和发育阶段起到重要调节作用。最近几年,运用新的生物技术对昆虫几丁质酶的结构,时空表达,和组织特异性表达以及生物学功能进行了深入研究,取得了许多新的成果。本文就昆虫几丁质酶基因的结构特征,几丁质酶生理功能、重组表达特点、酶活测定方法及影响酶活性因素等方面进行讨论与综述。     

含两种抗真菌基因植物表达载体的构建

近年来,植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视．并取得了显著进展,目前主要是通过转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因来提高这两种酶在植物体内的表达水平,以此增强抗真菌病害的能力。体外抑菌实验表明：β-1,3-葡聚糖酶能够抑制某些真菌的生长,而一旦与几丁质酶共同作用时,其抑菌作用会大大增强。本实验将几丁质酶和葡聚糖酶     

山冈单胞菌ZL261几丁质酶基因的克隆及原核表达

分离自西藏色季拉山海拔4 530 m高山草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZL261具有很高的几丁质酶活性,为了明确其几丁质酶种类及作用特点,依据已报道的食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)Ter331胞外内切几丁质酶基因chiI相关序列设计引物,利用分段扩增的方法得到了菌株ZL261几丁质酶基因,并对其序列和编码蛋白的氨基酸进行分析。结果表明,全长1 338 bp的chiIQ基因编码的几丁质酶ChiIQ由445个氨基酸组成,分子量为46.04 kDa,等电点为5.67。序列比对和同源性分析发现,该基因与食真菌山冈单胞菌Ter331几丁质酶基因chiI序列相似性最高(92%),其氨基酸序列含有几丁质酶GH18家族高度保守序列SXGG和GXDXDXE,因此,ChiIQ属GH18家族。利用双酶切法构建了ZL261几丁质酶基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。本试验结果为后期研究几丁质酶在山冈单胞菌生防应用中的功能以及生防菌ZL261的开发和应用奠定了基础。     

土壤真菌群落和潜在功能对施加外源Bt毒素的响应

【目的】转Bt基因植物和Bt菌生物农药释放的Bt毒素是一类具有生物毒性的潜在环境外源污染物，Bt毒素环境行为和生态效应是转基因植物和植物用转基因微生物安全风险评价的重要内容，但是外源Bt毒素对土壤真菌群落和潜在功能的影响还不清楚。【结果】本研究发现，Bt毒素施加量和培养时间均可以显著影响土壤真菌群落组成，且随着Bt毒素施加量增加和土壤培养时间延长，土壤真菌群落差异性逐渐变大。施加Bt毒素提高了土壤真菌群落香农指数和关联网络的负相关性比例及模块数，因而没有对土壤真菌群落的多样性和稳定性产生负面影响。【结论】上述结果表明，评估Bt毒素的环境行为及微生态效应要关注Bt毒素施加量及其长期影响。随着Bt毒素施加量增加，Phymatotrichopsis、Homalogastra、Geosmithia和Apiotrichum等真菌以及参与蛋白质降解、碳素代谢和磷素代谢的功能基因编码酶相对丰度显著升高，推测上述真菌物种和潜在功能参与了Bt毒素在土壤中的降解和转化过程。研究结果为转Bt基因植物、Bt重组菌生物农药以及Bt毒素的生态安全风险评价提供了科学参考和理论依据。     

微生物几丁质酶的分子生物学研究及其应用*

几丁质酶是广泛存在于植物、真菌以及细菌等生物体内的一种分解几丁质的蛋白质。综述重点介绍了微生物几丁质酶基因克隆、功能分析以及将几丁质酶作为生物靶标进行杀虫和抗病的应用前景。     

生物信息学在几丁质酶研究中的应用

几丁质酶在防治病原真菌,抵御农业害虫,参与共生固氮及植物的生长调控等方面都有重要作用。几丁质酶种类较多,在大小、三维结构、理化性质和酶学性质等方面差异较大,因而,采用生物信息学方法快速有效地分析几丁质酶是十分有必要的。对将生物信息学应用到新型几丁质酶基因的发现、几丁质酶的结构分析、几丁质酶的后基因组分析以及在几丁质酶分析中出现的问题等几方面进行了综述。     

几丁质酶在农业方面的应用研究概况

目前,合成类杀虫剂和杀真菌剂的滥用造成了严重的环境污染。而几丁质酶有潜在的抗含几丁质的病原体的特性,因此在农业方面应用前景广泛。综述了在几丁质酶抗植物病原真菌、杀虫、抗细菌和果蔬采后病害的防治等方面的应用研究情况。在此基础上,对几丁质酶在生物农业上的应用前景进行了展望。     

黄淮地区部分土壤中几丁质降解微生物及土壤几丁质酶活性

分析了采自黄淮部分地区２６个土样口的几丁质降解微生物的数量，种类和土壤几丁质酶活性，这些土壤中普遍存在大量的几丁质降解微生物，并可检测出几丁质酶活性，几丁质酶应是土壤累积的酶的一种，属于水解酶类。     

曲霉Aspergillus sojae壳聚糖酶的诱导及特性

曲霉(Aspergillus sojae)在Czapek-Dox培养基中加入2％N-乙酰氨基葡糖、1％蛋白胨和0．5％酵母膏，26℃、150r／min摇瓶培养下，在60h诱导产生较强的壳聚糖酶活性(达12．34mU／mL)，同时形成了4种壳聚糖同工酶，CHA1、CHA2、CHA3和cHA4，蛋白质分子量约为38．2、30．8、27．7和25．0kD。对诱导的壳聚糖酶部分特性初步研究表明，该酶属于壳聚糖内切酶，不能分解胶体几丁质、乙二醇几丁质、干粉几丁质和羧甲基纤维素，但能随乙酰化程度的增加有效分解壳聚糖。利用薄层层析表明，该酶可将壳聚糖分解得到的产物为壳聚二糖。