大丽轮枝菌侵染拟南芥的过程及诱导的防御反应研究

为进一步了解大丽轮枝菌的致病机制,本研究以绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌菌系为材料,研究其对拟南芥的侵染过程和诱导拟南芥产生的防御反应。结果表明,大丽轮枝菌能侵染拟南芥,接菌6h后,分生孢子吸附在根表面,2~3 d到达皮层,9 d到达维管束,随后迅速扩展,接菌后11 d完成系统侵染,产生黄萎病症状。大丽轮枝菌在侵染过程中,能诱导拟南芥胼胝质、活性氧的产生和防御酶活性升高,植物产生的防御反应特征明显。本研究结果为大丽轮枝菌致病机理研究提供了理论依据。     

土传病原细菌的生存与致病权衡

土传病原细菌严重威胁土壤-植物系统健康和农业可持续发展。在接触和入侵寄主植物根系之前,病原细菌会经受土壤pH、含氧量、营养物质种类和数量等非生物因素骤变以及其他土壤微生物的竞争、寄生和捕食等生物胁迫。病原细菌的生物膜形成、代谢、运动、毒力、DNA修复以及对噬菌体、抗生素或环境压力的抵抗能力等特性对其在土壤环境中生存和侵染寄主非常重要。为适应复杂且多变的土壤生物和非生物环境,病原细菌必须动态权衡其生存和致病力之间的关系,维持其生存、传播、增殖和侵染致病间的平衡,以最大化其在土壤环境中的适应性。系统理解土传病原细菌应对胁迫和侵染寄主植物的过程及权衡机制是建立精准、高效生态防控手段的关键。为此,以土传病原细菌为代表,总结了土传病原细菌生存与致病的权衡规律和典型现象及土壤中的生物和非生物影响因素,阐述了土传病原细菌入侵植物根际过程中的生存与致病权衡机制,并提出一些与土传病原细菌生存与致病权衡相关的科学问题,呼吁建立基于生存-致病权衡理论的土传病害生态防控策略,为绿色农业可持续发展提供理论参考。     

土传病原细菌的生存与致病权衡

土传病原细菌严重威胁土壤-植物系统健康和农业可持续发展。在接触和入侵寄主植物根系之前,病原细菌会经受土壤pH、含氧量、营养物质种类和数量等非生物因素骤变以及其他土壤微生物的竞争、寄生和捕食等生物胁迫。病原细菌的生物膜形成、代谢、运动、毒力、DNA修复以及对噬菌体、抗生素或环境压力的抵抗能力等特性对其在土壤环境中生存和侵染寄主非常重要。为适应复杂且多变的土壤生物和非生物环境,病原细菌必须动态权衡其生存和致病力之间的关系,维持其生存、传播、增殖和侵染致病间的平衡,以最大化其在土壤环境中的适应性。系统理解土传病原细菌应对胁迫和侵染寄主植物的过程及权衡机制是建立精准、高效生态防控手段的关键。为此,以土传病原细菌为代表,总结了土传病原细菌生存与致病的权衡规律和典型现象及土壤中的生物和非生物影响因素,阐述了土传病原细菌入侵植物根际过程中的生存与致病权衡机制,并提出一些与土传病原细菌生存与致病权衡相关的科学问题,呼吁建立基于生存-致病权衡理论的土传病害生态防控策略,为绿色农业可持续发展提供理论参考。     

昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良

摘要：随着大量施用化学农药所造成的环境污染等问题日益突出，真菌杀虫剂的研究和开发受到了广泛的关注。由于存在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点，昆虫病原真菌的广泛应用受到限制。因此，有必要弄清昆虫病原真菌致病寄主过程的遗传学和分子生物学机理，找出控制毒力的主效基因。在此基础上，利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力，创造出更适合市场需要的真菌杀虫剂。文章重点介绍了近年来有关昆虫病原真菌致病机理的研究进展，包括侵染寄主过程中附着胞的形成、降解昆虫体壁的分子机理和昆虫病原真菌的毒素等。同时，还介绍了昆虫病原真菌的遗传转化方法和基因工程改良的一些新进展。     

棉花品种黄萎病抗性与免疫反应的关系

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传真菌病害,不同棉花品种对黄萎病的抗性不同。为了比较不同棉花品种对黄萎病菌的免疫反应程度与抗黄萎病水平间的关系,利用4×106CFU·m L~(-1)的大丽轮枝菌孢子悬浮液处理6个不同棉花品种的根系,进行抗病性评价。结果表明,接种大丽轮枝菌后,棉花植株的根、下胚轴、叶等器官中大丽轮枝菌的生物量随品种抗病性的增强而减少,根部木质素、叶片胼胝质含量随抗病性的增强而增多,L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的升高幅度随抗病性的增强而增大。由此可见,大丽轮枝菌侵染棉花后,植株的免疫反应程度越强其抗病性越强。本研究结果为棉花与黄萎病菌互作机制的进一步研究提供了理论依据。     

利用微生物防除根寄生杂草列当

根寄生杂草列当(Orobanche spp.)已经严重制约全球许多地区的农业发展,寻找有效防除措施迫在眉睫。由于列当具有特殊生活史且与寄主关系密切,常规防除杂草措施难以达到理想防效。目前,尚无既能有效防除列当又不对寄主造成危害且便于大规模推广应用的列当防除措施。在众多列当防除措施中,微生物防除越来越引起关注和重视。本文对微生物防除列当的国内外研究进展及防除机理进行了综述。目前,列当生防微生物的研究主要集中在镰刀菌(Fusarium spp.)等列当病原菌和根瘤菌(Rhizobium spp.)等列当寄主植物共生菌上。微生物防除列当的机制主要包括两方面:一是通过产生代谢产物直接影响列当的萌发和生长,或通过降解列当种子萌发诱导物质间接影响列当的萌发;二是通过提高寄主植物自身对列当的抗性间接影响列当的寄生和生长。此外,本文还重点介绍了植物土传病害的土壤拮抗微生物防除列当杂草的可行性及研究进展。植物土传病害病原菌和列当均首先通过在地下侵染作物的根系进而危害作物正常生长,而作物抗土传病害的机理也与抗列当的机理类似。因此,存在于土壤中具有防治植物土传病害能力的微生物可能也具有防除根寄生杂草列当的功能。本团队前期试验从植物土传病害的土壤拮抗微生物中筛选到在盆栽试验中能够有效防除向日葵列当(O.cumana Wallr.)和瓜列当(O.aegyptiaca Pers.)的放线菌各1株,分别为淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis Sveshnikova)和密旋链霉菌(Streptomyces pactum Bhuyan B.K)。其中,密旋链霉菌的菌剂在田间试验中既降低了瓜列当的出土数量又增加了番茄的产量。总之,微生物是防除根寄生杂草列当的一条有效途径。     

水稻条纹病毒与水稻互作中的生长素调控

利用real-time RT-PCR和高效液相色谱技术对水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）病株和RSV侵染的水稻悬浮细胞中生长素合成酶基因YUCAA1和内源生长素的相对表达量和含量进行分析结果表明,在细胞水平,RSV侵染能显著引起YUCAA1基因表达上调2.98倍和内源生长素含量升高2.66倍。而在植株水平,RSV侵染后却导致YUCAA1基因表达下调70%和内源生长素含量降低75%。这暗示RSV与寄主互作的不同阶段能够调控寄主植物生长素的信号传导。同时,利用KPSC缓冲液处理来消除病株内源生长素,能够引起RSV CP基因表达上调近3倍,30 μM IAA溶液处理可使病株内RSV CP基因表达下调45％。由此可见水稻体内生长素含量的变化能够影响RSV在寄主体内的复制。     

病原青枯菌土壤存活的影响因素研究进展

土传青枯病是一种毁灭性的细菌性病害,广泛分布于热带、亚热带和温带地区,严重威胁世界粮食安全。病原青枯菌主要从土壤中侵染作物根系,其在土壤中存活能力强,因此防治极为困难。明确病原青枯菌土壤存活的关键影响因素有助于开发高效阻控土传青枯病的措施。国内外学者在青枯菌的土壤存活方面开展了大量研究,但由于影响青枯菌土壤存活的因素复杂,而相关研究多围绕单一因素展开,缺乏针对青枯菌土壤存活规律和影响因素的系统性认识。本文系统梳理了青枯菌的自身特性（基因、行为和代谢产物）及土壤生物、非生物因素对其在土壤中存活的影响,阐明了青枯菌在寄主存在时土体存活、向寄主根表方向运动迁移时根际存活以及入侵寄主根系时根表存活的主要影响因子,以期为土传青枯病的系统阻控提供参考。     

根系分泌物抑制连作障碍线虫病的根际调控机制及其应用

作物长期连作极易出现连作障碍(再生病害),本文围绕因传统耕作模式和种植习惯而诱发的新疆棉花、黑龙江大豆、河南花生、山东设施蔬菜、两广香蕉等连作障碍问题,对全国连作现象进行系统分析,发现全国连作现象普遍。按照耕地面积将连作障碍划分为五个等级,其中华北三省和东北的黑龙江省连作障碍等级最高,且各省连作现象均以大田经济作物为主。以香蕉、大豆(大田经济作物)、黄瓜(设施园艺作物)和三七(中草药)为代表,比对最低产量和正常产量在连作年份的变化,表明连作障碍发生规律成抛物线式,防控连作障碍需找到问题关键时期。单一根系分泌物介导的微生物多样性降低、病原菌富集,植物寄生线虫危害和土壤弱化是导致连作障碍的主要原因,其中线虫对植物的侵染危害作为土传病害是防治连作障碍中最难解决的问题之一,尤其是在设施蔬菜上。线虫在长期进化过程中形成了具有识别、寻找和侵染寄主的生物学功能,而不同植物根系分泌物对线虫发育和对宿主的识别侵染能力有不同的调控作用。针对根系分泌物–线虫互作为诱因的线虫病害,深入探讨易感作物和抗性/非寄主植物根系分泌物对线虫发育和对植物侵染的生物学机制,提出根际调控措施。在J2时期利用抗性/非寄主植物根系分泌物,调控根结线虫Mi-16D10、Mi-flp-18等基因和孢囊线虫的Hg-rbp-2等基因的表达控制线虫的发育、侵染和迁移,通过生物源功能物质定向防控线虫侵染作物。这些结果加深了我们对生物活性物质调控植物寄生线虫机制的认识。未来,以筛选和鉴定抗性或非寄主作物特异根系分泌物对线虫侵染的调控为依据,配置生物功能型肥料,利用植物源活性物质替代传统农药控制线虫病害的根际调控措施,定向调控植物根际生物学过程将成为国内外研究热点。此文将为未来深入系统地研究根系分泌物–线虫的相互作用及克服连作障碍提供理论基础,进而促进土壤健康和作物优质高产高效,对实现绿色农业和可持续发展具有重要的理论和实践指导意义。     

硝/铵营养对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响

通过室内平板培养,研究了不同硝/铵配比的氮源,以及不同的pH对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响。结果表明: 1）在所有不同硝/铵配比处理中,低pH（pH=4）均抑制尖孢镰刀菌的生长。在相同pH值条件下,100%铵态氮处理中尖孢镰刀菌的生长受到明显抑制,其菌落直径均小于4 cm; 2）在不同浓度铵处理后,尖孢镰刀菌的生长在铵态氮大于5 mmol/L时受到强烈的抑制; 3）通过模拟植物细胞壁被尖孢镰刀菌侵染并穿透的过程中发现,尖孢镰刀菌在100%铵态氮处理下不能穿透赛璐膜。本研究结果说明,铵态氮能够控制香蕉尖孢镰刀菌的生长,并抑制其侵染穿透寄主细胞壁。     

棉花内生解淀粉芽孢杆菌489-2-2对棉花黄萎病的防效研究

为更好地防治棉花黄萎病,在冀棉11根系中分离得到一株对大丽轮枝菌抗性明显的内生细菌,经分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌489-2-2。本试验以489-2-2为材料,研究该菌株对棉花黄萎病的防效和机理。结果表明,解淀粉芽孢杆菌489-2-2能够抑制黄萎病菌Vd080的生长,可导致Vd080菌丝形态异常。用该菌株发酵液浸泡棉花种子,对棉花黄萎病的防效为54.99%,灌根法的防效为60.31%。解淀粉芽孢杆菌489-2-2能使植株产生防御酶,诱导的免疫反应较强,且该菌株能定殖到棉花幼苗根系内部。本研究结果为解淀粉芽孢杆菌489-2-2的利用提供了理论依据。     

陆地棉GhSUMO基因的克隆与黄萎病菌诱导表达分析

SUMO化修饰与植物抗病防御、信号转导和耐旱等有着直接的关系。本文以抑制差减杂交（sup—pression subtractive hybridization．SSH）技术获得SUMO的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和电子克隆,获得了全长为396bp的SUMO基因编码区cDNA全长,我们将该基因命名为GhSUMO,推测该基因编码95个氨基酸。分别以抗黄萎病陆地棉品种豫棉21号的cDNA和DNA为模板,对该基因进行了PCR扩增验证,测序结果表明,GhSUMO基因序列与电子克隆序列一致,且没有内含子。蛋白序列分析表明,该蛋白具有保守泛素结构域和C端双Gly的断裂／连接位点,以及保守的疏水表面和Ulpl—Smt3互作位点。系统进化分析表明,该蛋白与蓖麻的同源序列表现了最高的相似性,与其它双子叶植物同源序列次之,而与单子叶植物的相似性较低。棉苗接菌后实时定量PCR结果显示,该基因表达量在接黄萎病菌的量48h后明显上调,96h达到未接菌对照的5倍以上。GhsSUMO基因可受黄萎病菌诱导表达,表明该基因在陆地棉抗黄萎病的机制中可能发挥重要作用。     

陆地棉酵母双杂交cDNA文库及VdSCP7诱饵载体的构建

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNase Ⅰ处理后,用RNA 5'末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×10⁶ CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×10⁹ CFU·mL^-1,满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。     

Antagonist Bacillus subtilis HJ5 controls Verticillium wilt of cotton by root colonization and biofilm formation

Cotton plants that are continuously subjected to monoculture suffer greatly from Verticillium wilt disease. The application of a novel bioorganic fertilizer (BOF) consisting of organic fertilizer combined with the antagonistic Bacillus subtilis strain HJ5 significantly suppressed Verticillium wilt of cotton. The disease incidence rates in soils that were treated with BOF (1 %, w/w) in the nursery stage, in the transplanted soil stage or in both stages, decreased by 42.9 %, 57.1 %, and 88.0 %, respectively, compared with controls. B. subtilis HJ5 was tagged with a plasmid-borne gfp gene encoding the green fluorescent protein to investigate its colonization behavior on cotton root surfaces. The results indicated that B. subtilis HJ5 predominantly colonizes the elongation and differentiation zones of the roots and forms micro-colonies in hydroponic and soil systems. The population of B. subtilis HJ5 in the rhizosphere and on cotton roots was also monitored. The number of B. subtilis HJ5 cells on the root surface reached a peak value of approximately 10⁷ cfu per gram of roots 3 days after exposure of the cotton seedlings to the bacteria. Probably the colonization of B. subtilis HJ5 on cotton roots is one of the mechanisms involved in protecting cotton plants from fungal infection.     

棉花黄萎病拮抗菌的筛选及其生物防治效果

筛选到2株拮抗菌ZJ6和ZJ1并对其进行了鉴定,研究了其在盆钵试验中防治棉花黄萎病的效果,通过PCR的方法扩增了其含有的抗生素合成基因.结果如下:1)根据生理生化特性和16S rDNA序列分析,菌株ZJ6和ZJ1均鉴定为Bacillus subtilis.2)拮抗菌ZJ6和ZJ1与复合有机肥(氨基酸肥料:猪粪堆肥=1:...     

不同腐解方式下棉秆腐解液对棉花枯、黄萎病菌的化感效应

采用自然腐解与接种微生物人工腐解两种方式分别处理棉秆,研究了两种腐解物水浸提液对棉花枯、黄萎病菌的化感效应。结果显示,两种腐解液对枯、黄萎病菌的菌丝生长及孢子萌发均具有较强的抑制作用,抑制强度整体上随着腐解液浓度的升高而增大。棉秆自然腐解液对枯、黄萎病菌菌丝生长的最大抑制率分别为58.17%、48.16%,对孢子萌发的最大抑制率分别为23.29%、16.22%,对枯、黄萎病菌毒力的有效中浓度（EC50）分别为33.20、45.20g·L-1;人工腐解液对枯、黄萎病菌菌丝生长的最高抑制率分别为71.63%、79.04%,对孢子萌发的最高抑制率分别为35.45%、42.74%,EC50分别为24.18、20.75g·L-1。表明棉秆腐解后具有作为植物源抑菌剂的开发潜力,并且采用人工方式腐解棉秆能有效提高腐解液对棉花枯、黄萎病菌的抑制强度。     

棉花黄萎病生防菌脂肽类抑菌物质分离和鉴定

棉花黄萎病(Cotton Verticillium Wilt)是一种由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的严重危害棉花生产的土传维管束病害[1]。因大丽轮枝菌菌丝体产生的大量微菌核在土壤中存活时间长以及病原菌变异快等特点,造成培育抗病品种、使用化学药剂和利用新的栽培技术等方法防病效果均不理想。近年来,以生物防治为主的综合防治措施日益受到人们重视,并取得了一定效果[2-4];该措施     

土传棉花黄萎病拮抗菌的筛选及其生物效应

实验采用平板对峙法,从黄萎病发生严重的棉田中的健康植株根际土壤中分离筛选到11株对棉花黄萎病致病菌Verticillium dahliaeKleb(Vd)具有拮抗效果的菌株,抑菌率在51.8%和87.4%之间,经培养滤液抑菌率试验复筛,选择抑菌效果较好的3株菌株进行盆栽试验。结果表明:在施用拮抗菌摇床培养液(VS)、有机肥(VF)和两者结合(VFS)的3个处理中,VFS效果最显著,防病率达57%,植株生理性状显著改善,根际可培养微生物数量发生显著变化,细菌数量增加7.3~13.4倍、放线菌数量增加3.2~5.9倍,病原菌微菌核数量下降34%。结合生理生化和16S rDNA技术鉴定,初步确定供试的2株菌为死谷芽孢杆菌(Ba-cillus vallismortis),1株菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。研究表明拮抗菌与有机肥共同施用不仅可以起到防病的作用,而且可以使棉花连作土壤微生物区系向健康、合理的方向发展。本文首次报道了死谷芽孢杆菌对棉花黄萎病有抑制作用。     

棉花黄萎病拮抗细菌HMB-1005鉴定及定殖

以大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)为指示菌,对从棉田土壤中已经分离筛选到的细菌HMB-1005进行形态、19项生理生化特征及16S rDNA试验,结果表明,HMB-1005为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);通过灭菌土和非灭菌土进行盆栽试验,拮抗菌HMB-1005芽孢液浸种、土壤全部混菌和部分混菌3种处理,经过5个月的盆栽试验表明,拮抗细菌HMB-1005能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达106cfu/g土左右,并仍能保持较高的抑菌活性。通过对棉苗根内细菌的分离,证实拮抗细菌HMB-1005能在棉花根内定殖,数量达到103cfu/g。实验结果显示,灭菌土的拮抗菌数高于非灭菌土,并且3种处理方式差异不明显,在实际生产应用中,建议使用浸种方法。     

砂培条件下两种磷效率棉花根系形态及根际特征差异

为对比两种磷效率棉花在两种磷水平(0.1和5 mmol/L)的根系形态和根际特征的差异。以磷高效型棉花ZM42和磷低效型棉花XLZ13为研究对象设计砂培花盆分层试验,测定生物量、吸磷量、根系形态数据、分层Olsen－P、 pH值和酸性磷酸酶。结果表明：在砂培条件下两种磷效率棉花生物量和磷素积累量随施磷量的增加均有不同程度增加; ZM42在两种磷处理的根部生物量、吸磷量以及根冠比都优于XLZ13。在两种磷处理下, ZM42根系中根径(0~0.4 mm)的细根长度较XLZ13长,细根在总根长中的比例较高。总根长中细根越多有利于促进植株对磷的吸收。生长介质中磷含量降低时,棉花根际pH值也随之降低,高效品种ZM42的根际pH值降低幅度显著高于XLZ13;两种磷效率棉花在两个时期的根际土壤磷酸酶活性均随着施磷量的减少而增加,磷高效棉花ZM42分泌的土壤磷酸酶活性均高于磷低效棉花XLZ13。由此可见,两种磷效率棉花在相同生长介质中根际机理存在差异,且在低磷胁迫下磷高效棉花根系形态特征改变是根际磷活化主要机理之一。