猪ATGL基因特异性siRNA表达载体的构建及鉴定

ATGL是一种新发现的甘油三酯分解酶。根据猪ATGL基因全长cDNA序列,设计合成其特异性RNA干扰片段,将其克隆入pSilencer 4.1-CMV neo干扰载体中,构建猪ATGL基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并对其进行PCR、双酶切及测序鉴定。结果表明,成功构建了猪ATGL基因的特异性siRNA表达载体。这为进一步利用RNAi技术研究猪ATGL基因在脂肪代谢中的功能奠定了基础。     

猪miR-369靶基因肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的鉴定

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的非编码小RNA分子,作为关键的转录后调控因子调控真核生物的基因表达,广泛参与细胞的生长发育、分化和凋亡等生物学过程。本研究通过生物信息学预测发现,猪(Susscrofa)肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的3’非编码区具有2个潜在的miR-369的靶位点。并进一步通过双荧光素酶报告系统分析,将猪TNF-α3’非编码区构建到双荧光素酶载体中,转染至猪髋动脉内皮细胞系,荧光素酶活性测定显示,miR-369过表达组的荧光比值显著低于对照组(P<0.05),而miR-369抑制组相比对照组没有显著差异(P=0.752)。研究结果提示,猪miR-369能靶向调控TNF-α的表达,对深入研究脂肪沉积性状重要候选基因TNF-α的转录后调控机制具有重要价值。     

FAS和HSL mRNA在猪背最长肌的表达及其与肌内脂肪含量的关系

采用100头肥育期苏太猪,屠宰取背最长肌样品.测定各样品肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量,并根据IMF含量将样品分成高、中、低3个组,每组取肌内脂肪含量位于中间的20个个体为研究对象,共计60个个体,各组IMF百分含量(%)分别为(6.00±1.14)、(9.46±0.94)和(13.77±2.12).采用RT-PCR方法测定各样品中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和激素敏感脂酶(hormone-sensitivelipase,HSL)mRNA水平,并分析其与肌内脂肪含量之间的相关性,以揭示FAS和HSL的表达与肌内脂肪沉积的关系.结果表明,FAS或HSL基因表达水平与肌内脂肪含量之间并无显著的相关(P＞0.05),FAS与HSLmRNA的比值与肌内脂肪含量之间存在着显著的正相关(R=0.464,P＜0.01,P=60).不同组别之间,随着肌内脂肪含量的增加,FAS与HSL比值有升高的趋势.推测FAS和HSL在猪背最长肌肌内脂肪的沉积中发挥着作用.     

基于一种新的天花板培养方法分析猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因表达模式

成熟脂肪细胞在天花板培养(ceiling culture)条件下可自发去分化为不含脂滴的成纤维细胞(dedifferentiated fat cell,DFAT),这种细胞体外可向多个谱系分化,因此近年来备受人们关注。为研究猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因表达规律,本研究先分离、鉴定了猪成熟脂肪细胞,然后采用一种新的天花板培养法使其发生去分化,再用实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析了猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因的表达变化,最后用1μmol/L罗格列酮(Rosiglitazone)处理猪成熟脂肪细胞,研究增强成脂对去分化的影响。结果显示:分离的猪成熟脂肪细胞的纯度高达98.7%,并且新式天花板培养法能够高效的使其发生去分化;在去分化的过程中中后期成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)和脂蛋白酯酶(LPL)的mRNA水平分别上调了8、3和7.5倍,而脂肪分解关键基因激素敏感脂酶(HSL)和脂肪组织甘油三酯脂肪酶(ATGL)的mRNA水平分别上调了40倍和10倍;罗格列酮处理能够显著抑制猪成熟脂肪细胞去分化(P<0.05)。这些结果说明,成熟脂肪细胞去分化是一个以脂解为主并伴有一定水平成脂的脂代谢过程,这为进一步研究成熟脂肪细胞去分化机理提供了理论依据。     

miR-378基因敲除对小鼠脂肪分解的影响

在饥饿状态下,机体脂肪内参与能量代谢的许多基因会发生改变来适应环境的变化,从而维持人(Homo sapiens)和动物在没有食物摄入时的生存需要。为了探究mi R-378在短期饥饿(24 h)状态下脂肪代谢中发挥的作用,本研究采用野生型和mi R-378基因敲除型小鼠(Mus musculus)为材料,分别对小鼠进行正常饲喂及高脂诱导,采集两月龄及高脂诱导两个月的小鼠棕色脂肪、腹股沟脂肪、性腺脂肪、肾周脂肪及皮下脂肪组织,利用q RT-PCR检测脂肪合成和分解相关基因m RNA的表达量,来探讨饥饿状态下mi R-378基因敲除对脂肪分解的影响。实验表明在饥饿状态下脂肪合成基因Pparγ表达量降低,而脂肪分解基因激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)、长链脂酰辅酶A合成酶1(acyl-Col synthetase long-chain family member 1,Acsl1)和长链脂酰辅酶A脱氢酶(acyl-Coenzyme A dehydrogenase,long-chain,Acadl)表达量升高,同时mi R-378在脂肪中的表达量有所升高。mi R-378敲除组与野生组相比在饥饿时脂肪分解标志基因下调。研究结果表明,mi R-378可促进禁食状态下脂肪组织的分解,敲除mi R-378后抑制禁食状态下脂肪组织的分解。本研究确定了mi R-378可作为重要的调节因子影响小鼠脂肪的分解,为人及其他动物脂肪分解的研究提供了重要的理论依据。     

慢病毒介导shRNA干扰颗粒体蛋白前体(GRN)促进猪前体脂肪细胞分化

为研究颗粒体蛋白前体(granulin,GRN)在脂肪细胞发育过程中的作用,本实验构建了GRN短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA的表达变化情况。结果显示,GRN慢病毒干扰载体病毒滴度在5×107TU/mL以上,病毒感染前体脂肪细胞后显著降低了GRN的表达,shRNA2干扰效率最高,达到76%,沉默GRN后能够促进猪前体脂肪细胞分化;脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白(SREBP-1c)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(ap2)和脂蛋白酯酶(LPL)基因mRNA表达量均升高。结果表明,降低GRN基因表达促进了猪前体脂肪细胞分化,揭示GRN在猪前体脂肪细胞分化过程中可能起到抑制作用。     

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与沉默信息调节因子1(Sirt1)抑制小鼠脂肪沉积

探讨沉默信息调节因子1(Sirt1)对小鼠脂肪沉积的抑制作用和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。用Sirt1的激动剂白藜芦醇(100mg·kg-·1d-1)和抑制剂尼克酰胺(500mg·kg-·1d-1)灌胃处理小鼠(Mus mussulus)15d,记录小鼠体质量变化,测定小鼠皮下脂肪、附睾脂肪和肾周脂肪的沉积量,试剂盒测定血脂指标,同时利用Real-timePCR分析与脂肪生成密切相关的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和脂解基因甘油三酯水解酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、围脂滴蛋白(Perilipin)及生脂基因脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达水平,检测mTOR通路关键因子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)和真核启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)mRNA表达水平。与对照组相比,白藜芦醇处理组小鼠体质量增加量和体脂含量均显著降低(P<0.01),血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)浓度均显著降低(P<0.01),而高密度脂蛋白(HDL-C)浓度升高(P<0.01),mTOR通路关键因子mTOR、4EBP1和S6K1mRNA表达水平降低(P<0.01),脂代谢相关基因PPARγ、SREBP1及成脂基因FASmRNA表达水平显著降低(P<0.01),脂解相关基因ATGL、HSL和PerilipinmRNA表达水平显著升高(P<0.01);烟酰胺处理组小鼠体质量、附睾脂肪以与皮下脂肪沉积量增加缓慢(P>0.05),肾周脂肪沉积量增加(P<0.05),血清中LDL-C浓度升高(P<0.05),HDL-C浓度降低(P<0.01),mTOR通路关键因子mTOR和4EBP1mRNA表达水平升高(P<0.01),而脂代谢调控相关因子PPARγ和SREBP1mRNA水平升高(P<0.05),ATGLmRNA表达量显著降低(P<0.05),FAS、HSL和PerilipinmRNA表达量变化不显著(P>0.05)。表明激活Sirt1可减少脂肪合成,增加脂肪分解,从而降低体脂沉积,而mTOR信号通路参与这个过程。     

大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料.     

反义RNA干扰MSTN对牛肌肉卫星细胞脂肪生成相关基因的影响

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员,在骨骼肌中高表达;敲除MSTN后,肌肉质量增加、脂肪含量变少,但抑制MSTN表达后,如何影响脂肪沉积,尚未研究清楚.为了探究抑制MSTN表达后对脂肪相关基因表达的影响,本研究利用反义RNA技术,成功构建了双向表达载体pMSTN-CMV-CAG-antiMSTN,并通过Western blot筛选出抑制效果最佳的MSTN的反义载体.利用最佳反义MSTN载体在牛(Bos taurus)肌肉卫星细胞中有效干扰MSTN表达后,检测了脂肪合成相关基因(脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN),乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1))、脂肪酸氧化分解相关基因(肉毒碱棕榈酰转移酶ⅠB(carnitine palmitoyltransferase 1b,CPT-ⅠB),乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase,ACOX1)和烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase 1,ECHDC1))以及脂肪转运蛋白(fatty acidtransport proteins,FATP)表达的变化.结果显示,在MSTN基因被干扰后,肌肉卫星细胞中脂肪酸合成相关基因表达量上调,脂肪氧化分解相关基因中ACOX1和CPT-1B表达量上调,而ECHDC1基因表达量下调,另外,FATP表达基本没有变化.MSTN功能缺失后,脂肪合成和脂肪氧化分解过程都得到了加强,所以MSTN敲除所导致的脂肪减少并不是由于抑制了脂肪合成,而是由于脂肪分解加强,为肌肉提供更多的能量.MSTN下调后,CPT-1B的表达上调最为显著,而CPT-1B是脂肪酸β氧化的关键基因,所以研究结果提示MSTN对于脂肪的影响主要是通过影响β氧化过程实现的.研究结果为MSTN下调所导致的脂肪含量下降提供了理论依据,为MSTN作用于脂肪沉积的机制做出了初步探讨.     

西农萨能奶山羊甘油三酯水解酶基因(ATGL)的cDNA克隆与组织表达分析

甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)是水解甘油三酯的关键酶.本研究采用RT-PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)ATGL基因的cDNA序列,其全长2 074 bp(GenBank收录号为:GQ918145),包括5'UTR 141 bp,CDS 1 461 bp,和3'UTR 472 bp,该基因编码486个氨基酸(GenBank收录号为:ADD25174).经氨基酸序列分析发现,山羊与GenBank中牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、猪(Sus scrofa)和人(Homo sapiens)的ATGL的相似性较高,均在85%以上.经蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为53 243.4 D,等电点为7.4,具有GXSXG(氨基乙酸-X-丝氨酸-X-氨基乙酸)脂肪酶活性特征结构和Patatin结构域及α/β水解酶折叠域,在N端存在跨膜螺旋结构,并且整个序列中不含信号肽.此外,本研究还通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对A TGL基因进行了组织表达分析.结果表明,在所检测的12个组织或器官中均有A TGL mRNA存在,其中皮下脂肪组织中表达最丰富,并且远远高于其它组织或器官,肺、乳腺次之,心脏相对最少.ATGL基因在奶山羊的乳腺组织中具有较高的表达水平,为该基因的功能研究提供了实验依据.     

猪脂蛋白脂酶基因片段的克隆及不同体重的表达差异

从杜长大母猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase LPL)基因，获得1条约689 bp的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α中。从筛选的阳性克隆中分离出LPL基因，测定其序列。分析表明，该片段为LPL cDNA的部分序列，编码229个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪脂肪组织中LPL cDNA部分序列同源性达到98%，氨基酸序列同源性达到99.1％。以LPL基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以β-actin 为内标，研究不同体重猪脂肪组织LPL基因表达的差异。结果发现，从刚出生到30 kg，LPL基因表达呈上升趋势，在30～50 kg，LPL基因表达呈下降趋势，50～90 kg，LPL基因表达又呈上升趋势。     

猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析

Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础.     

表达人CD47基因的巴马小型猪创建及其表达分析

异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应.     

一种新的猪α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达

提取经新城疫病毒诱导培养的猪外周血白细胞总RNA,RT-PCR扩增出猪α-干扰素基因并克隆到T载体.测序结果表明,扩增片段含有信号肽的猪α-干扰素完整基因,与GenBank上登录的猪α1-干扰素基因同源性为97.2%.亚克隆猪α-干扰素成熟蛋白编码基因并对其5'段前1个稀有密码子进行大肠杆菌(Escherchia coli)偏嗜性改造.构建了猪α-干扰素原核单纯表达载体pCIFNA,实现了猪α-干扰素在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的15.6%.表达产物以包涵体形式存在,用含6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,细胞病变抑制法测定结果表明,重组猪α-干扰素具有较高抗病毒活性,约为1.66x106U/mg.     

桃沙红果实α-甘露糖苷酶基因(α-man)克隆及其在软化过程中的表达分析

α-甘露糖苷酶(α-man)是植物体内N聚糖加工的关键酶,在控制果实软化和延长货架期方面起重要作用.明确α-man在桃果实软化中的生理功能及其调控机制对进一步阐明桃果实的成熟软化机理具有重要意义.以商业成熟期桃(Prunus persica)沙红果实为材料,采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆桃果实中α-man基因全长cDNA,并利用实时荧光PCR定量技术,检测了采后乙烯利和1-methylcyclo-propene(1-MCP)处理沙红果实软化过程中α-man基因的表达差异.结果表明:桃果实α-man基因的cDNA全长长3 491 bp,包含一个3 075 bp完整的开放阅读框,编码1 024个氨基酸(Genbank登录号:JX310861),N端含有NXT/S的糖基化位点,属糖基水解酶38家族.实时荧光PCR定量技术检测发现对照果实在贮藏第2天出现α-man的表达高峰;外源乙烯处理α-man基因表达高峰提前ld出现,且峰值显著高于对照果实;而1-MCP处理可使α-man基因的表达高峰延迟1d,且后期α-man基因的表达受到极显著抑制.据此推断桃果实α-man基因可能受乙烯生成和乙烯信号转导途径的调控,参与桃果实的软化过程.     

沉默鸡B-Fα基因对IL-2、IL-4和IL-6转录水平的影响

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)和白介素(interleukin, IL)都是重要的免疫分子,其中MHCⅠ类分子递呈内源性抗原并启动细胞免疫,IL则是重要的免疫调节因子。关于鸡(Gallus gallus) MHCⅠ类分子(又称为B-Fα)与下游调节因子IL基因的关系尚不明确。本研究旨在应用基因沉默法研究下调B-Fα基因表达对IL-2、IL-4、IL-6转录水平的影响。首先构建沉默鸡B-Fα基因的重组慢病毒载体。根据B-Fα基因和短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)序列的结构要求,筛选3段DNA序列并设计合成shRNA;利用限制性内切酶定向插入慢病毒表达质粒pLL3.7,获得重组质粒。分别将3个重组质粒转染293T细胞,均能表达标签蛋白并包装慢病毒。将3株重组病毒感染HD-11细胞,感染效率达95%以上。利用qRT-PCR进行检测分析显示,重组病毒干扰B-Fα基因表达,分别下调至39%、97%和61%。将其中干扰效果最佳的重组慢病毒(pLL-sh B-Fα-257)感染鸡源巨噬细胞系HD-11细胞,并检测IL-2、IL-4和IL-6的转录水平。结果显示,B-Fα基因表达下调的同时,IL基因转录水平受到不同程度的影响,其中IL-2表达下调(P0.01),IL-4上调(P0.05),IL-6没有明显变化。上述结果提示,应用基因沉默法可抑制B-Fα基因表达,并影响IL基因的转录水平,提示启动细胞免疫的B-Fα基因与下游调节免疫反应的细胞因子之间存在关联。本研究为深入探讨免疫反应的调控机理提供了基础资料。     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

IGF-Ⅰ、GH和CLA对脂肪前体细胞增殖、分化和基因表达的影响

为探讨类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生长激素(GH)和共轭亚油酸(CLA)对不同部位来源脂肪前体细胞的增殖和分化程度的影响,以大鼠(Rattus norveaicus)为实验模型,分别从附睾及皮下脂肪组织分离得到脂肪前体细胞,并在不同浓度的IGF-Ⅰ、GH和CLA处理后,用MTT法检测脂肪前体细胞的增殖,用油红O染色法检测脂肪前体细胞的分化聚脂程度。实验结果表明,各剂量IGF-Ⅰ和CLA均能够显著地促进大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化,但GH对大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化均无明显作用。为进一步观察IGF-Ⅰ和CLA对皮下脂肪组织的作用机制,实验采用半定量RT-PCR法检测细胞中PPARγ和C/EBPα基因表达水平,结果发现,100ng/mL IGF-I可显著上调大鼠脂肪前体细胞中PPARγ与C/EBPα基因表达水平;48ng/m LGH和100μmol/L CLA可显著促进PPARγ基因表达,但对C/EBPα mRNA表达无显著影响。结果示IGF-I可能主要通过上调PPARγ与C/EBPα基因的高水平表达进而促进大鼠脂肪前体细胞的分化,而CLA对脂肪前体细胞的作用在上调PPARγ的表达的同时,还作为PPARγ的配体激活该受体而发挥作用。     

基于途径工程的极大螺旋藻藻蓝蛋白α亚基的生物合成

根据极大螺旋藻(Spirulina maxima)藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,利用PCR技术从极大螺旋藻基因组DNA中克隆了与其生物合成相关的5个基因藻蓝蛋白α亚基蛋白基因(cpcA)、血红素氧化酶基因(hox1)、藻蓝素:铁硫蛋白氧化还原酶(pcyA)、藻蓝素裂合酶基因E(cpcE)和藻蓝素裂合酶基因F(cpcF),并将这些基因用相应的限制性内切酶酶切后,依次构建到表达载体pETDuet-1的两个外源基因表达盒内,转化Escherichia coli BL21(DE3),经氨苄青霉素抗性筛选,得到工程菌ZJGSU02.经测序确认,连接到pETDuet-1上的5个基因拼接正确.IPTG诱导后,工程菌培养液中的细胞呈现明显的蓝色,对照菌颜色没有发生变化.SDS-PAGE电泳结果显示,在21 kD处有一明显的条带.重组蛋白经锌离子溶液浸泡后,在紫外光激发下呈现桔色荧光.Western blot分析表明,重组蛋白能特异性地与6×His-tag单克隆抗体结合.通过吸收光谱和荧光光谱检测,发现重组蛋白最大吸收波长为623 nm,最大荧光发射波长为645.8 nm,与天然极大螺旋藻中藻蓝蛋白α亚基的最大吸收波长和最大荧光发射波长一致,以上结果表明极大螺旋藻藻蓝蛋白α亚基已在大肠杆菌中成功实现异源表达.该研究结果不仅为色基结合蛋白这类复杂蛋白在异源宿主系统中的表达提供新的思路和方法,而且也为探索在一个表达载体上构建和表达5个或5个以上的外源目的蛋白基因及其基因互作等方面的研究提供借鉴.     

CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)与脂蛋白酯酶(LPL)基因在不同尾型绵羊品种尾部脂肪组织中的表达

本研究旨在发现CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)基因的表达对绵羊尾部脂肪含量的影响。本研究根据NCBI上牛(Bos taurus)C/EBPα基因(GenBank登录号:NM_176784.2)全长设计引物,克隆C/EBPα基因CDs序列,并用生物信息学方法分析序列和蛋白的特征;分别采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测C/EBPα和LPL基因在9月龄陕北细毛羊(长瘦尾型)、同羊(长脂尾型、短脂尾型)、西藏羊(短瘦尾型)、滩羊(长脂尾型)和哈萨克羊(肥臀型)5个品种绵羊(Ovis aries)共计18个个体的尾部脂肪组织中mRNA与蛋白的表达水平。结果表明,绵羊C/EBPα基因(GenBank登陆号:KF830871)编码区序列全长1 062 bp,编码353个氨基酸,理论等电点为7.25,相对分子量为37.15 kD,与牛C/EBPα基因的相似性达99%,其编码的蛋白含一个典型的亮氨酸拉链结构;C/EBPα和LPL蛋白与mRNA表达趋势大致相同,均在脂尾型(同羊和滩羊)和肥臀型(哈萨克羊)绵羊尾部脂肪组织中具有较高的表达水平,而在瘦尾型(陕北细毛羊和西藏羊)绵羊尾部脂肪中具有相对较低的表达水平,且在同一品种内,同羊长脂尾型尾部脂肪中C/EBPα和LPL mRNA与蛋白表达水平均显著高于短脂尾型(P0.05)。本研究成功克隆绵羊C/EBPα基因编码区序列全长,证明C/EBPα和LPL基因表达水平与绵羊尾部脂肪的沉积有显著相关性,为进一步探寻阻断尾部脂肪过度沉积的机制,实现既能节约饲养成本又能充分发挥本品种的优良生产性能这一目的提供基础资料。