应用酵母双杂交系统筛选与CASTOR相互作用的蛋白

CASTOR编码百脉根中的离子通道蛋白，它是共生途径上的功能基因，作用于结瘤因子诱导产生的钙离子激增（calcium spiking）信号转导途径的上游，突变后不能形成根瘤。为了进一步揭示CASTOR调控共生信号途径的分子机制，本文通过酵母双杂交系统在百脉根的cDNA文库中筛选可能与CASTOR相互作用的蛋白，以酵母配合的方法初筛获得111个阳性克隆，经β- Gal检测进一步确认有99个蓝色克隆子，测序以及NCBI BLAST比对分析鉴定出JAB1、CLPA、钙调素结合的翻译延伸因子等7种可能与CASTOR相互作用的蛋白，利用RT-PCR方法检测了这些基因在接种以及不接种根瘤菌的百脉根中的表达水平，分析推测CASTOR可能与上述蛋白形成复合物参与共生信号的转导。     

茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodansORS571基因组分泌蛋白的生物信息学分析

为了获取茎瘤固氮根瘤菌（AzorhizobiumcaulinodansORS571）的分泌蛋白，以便更深入地了解该菌的共生固氮作用，本研究采用SignalP、TMHMM、PSORTb、TargetP、LipoP、TatP和SecretomeP软件对该菌全部4717个蛋白序列进行分析预测。结果共识别了653个分泌蛋白，其中具有分泌型信号肽的蛋白54个，具有RR—motif型信号肽的蛋白1个，具有脂蛋白信号肽的蛋白2个和非经典分泌蛋白596个。该菌含信号肽分泌蛋白仅占全部蛋白的1．2％，低于其它固氮菌。在分泌蛋白中识别了核酸内切酶和核糖核酸酶等6个核酸酶。它们可能参与宿主植物遗传物质的降解，干扰宿主遗传代谢，进一步在宿主植物侵染过程中起到重要作用。此外还识别了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶等4个抗氧化酶。它们可能参与活性氧的清除以保护固氮酶，是该菌固氮过程的重要参与者。     

菜豆根瘤菌对土壤无机磷的活化释放作用

以土壤为磷源,通过液体培养研究了7株菜豆根瘤菌(Rhizobium sp.)对土壤磷的利用。结果表明,菜豆根瘤菌能释放大量的氢离子,使液体培养基的pH大幅度降低,氢离子的浓度至少提高20倍以上。根瘤菌分泌有机酸的种类与数量因菌株不同而异,这些有机酸包括甲酸、乙酸、草酸、丁二酸、柠檬酸、苹果酸和乳酸等,大部分根瘤菌能分泌乙酸。在接种根瘤菌的液体培养基中,全磷含量显著高于不接种的液体培养基,土壤无机磷总量则显著降低。由于土壤是培养基磷的唯一来源,故根瘤菌可促进土壤无机磷的溶解释放。相关分析表明,培养基的pH与土壤无机磷总量呈极显著正相关(r=0.893**,n=8),说明根瘤菌分泌的氢离子可能是溶解土壤无机磷的原因之一。接种根瘤菌显著降低土壤闭蓄态磷,土壤中的铁磷、铝磷和钙磷因菌株不同而降低,其原因可能与有机酸分泌的数量和种类有关。根瘤菌既能释放氢离子又可分泌多种有机酸的现象表明其活化土壤无机磷的方式具有多样性,可能有益于豆科植物利用不同形态的难溶性磷,使之适应各种不同的低磷土壤。     

GAF结构域的研究进展

GAF结构域广泛存在于各种蛋白中,其主要通过结合环核苷酸cGMP、cAMP、生色团和血基质等小分子作为信号分子、光或者气味受体,配合其他调节结构域稳定蛋白质构象和传递信号。本文简要综述了GAF结构域的基本特征、分类、结构及功能,为阐明一些重要信号转导途径及抗逆性研究提供了一定的理论依据。     

十字花科黑腐病菌中GGDEF结构域蛋白差异的in sillco分析

近年来,含有GGDEF结构域（含有甘氨酸（G）（2个）,天冬氨酸（D）,谷氨酸（E）,苯丙氨酸（F）保守氨基酸）的蛋白受到重视,已证实含GGDEF结构域蛋白在细胞信号转导、生长和致病性等方面发挥了重要作用。十字花科黑腐菌8004菌株（Xanthomonas campestris pv. campestris str. 8004,Xcc8004）有32个基因编码含GGDEF结构域蛋白,实验证明其中部分蛋白与xcc致病性、胞外酶产生、生物膜形成和泳动等生命活动相关。本文利用互联网提供的生物信息学资源,对Xcc8004不同功能含GGDEF结构域蛋白进行生物信息学分析,着重分析其结构域架构。对蛋白结构域架构整体比较显示,这些蛋白的整体结构域架构具有多样性,共有结构域架构仅有PAS4-GGDEF．EAL（分布于参与致病的蛋白中1;对结构域架构局部比较显示,在参与致病性的含GGDEF结构域蛋白中,PAS4-GGDEF和GGDEF．EAL为共有结构域架构;在参与内切葡聚糖酶产生的蛋白中,PAS4-PAS4、PAS4-GGDEF和GGDEF—EAL为共有结构域架构。本研究结果将为蛋白质功能预测提供线索。     

牛白细胞介素1受体相关激酶2（IRAK2）基因的克隆及生物信息学分析

Toll样受体 (toll-like receptors,TLRs)可识别病原体相关分子模式,通过下游信号转导激活免疫细胞,在天然免疫和适应性免疫应答中起着重要的作用,而白细胞介素1受体相关激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2,IRAK2)为TLRs信号转导通路下游重要的分子,起着信号转导与调控作用。为了深入研究牛TLRs信号转导通路对牛病原体所致疾病抗性中的主要作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了牛IRAK2基因的cDNA和进行了基因表达谱分析,并对其基因序列和所编码的蛋白质的结构特征进行了生物信息学分析。结果表明,牛IRAK2基因在乳腺、肝、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达,其序列全长为2 148 bp(GenBank登录号为EU528620),包括36 bp的5'非翻译区（1~36）,1 866 bp的CDS区（37~1 902）和246 bp的3'非翻译区（1 903~2 148）,编码622个氨基酸,其分子量为68 628.31 D,等电点为5.3。IRAK2蛋白含有一个DD结构域和一个S_TKc结构域,位于细胞核、细胞质、线粒体和质膜上,通过DD和S_TKc结构域对TLRs的信号转导有着重要的作用。     

苹果甘露糖结合蛋白2基因(MdMBP2)的克隆及其重组蛋白的活性研究

甘露糖结合蛋白(MBP)是一类包含B-lectin结构域的植物凝集素,通过与糖的结合参与多种生理过程,包括细胞和细胞之间的相互作用以及寄主和病原之间的相互作用等.为了探讨苹果甘露糖结合蛋白在抗轮纹病防御反应中的作用,本研究从苹果(Malus demestica)枝条韧皮部cDNA鉴定了一个甘露糖结合蛋白的编码基因,命名为MdMBP2(GenBank accession No.JX126857).该基因全长1 553 bp,开放阅读框为1 368 bp,编码一个由455个氨基酸残基组成的蛋白质,分子量和等电点分别为50.4 kD和8.68.该蛋白的氨基酸序列包含保守的B-lectin结构域,N端有27个氨基酸残基组成的信号肽,C端有一个PAN-apple结构域.同源性和系统演化分析显示,MdMBP2蛋白与葡萄(Vitis vinifera)和大豆(Glycinemax)的表皮分泌蛋白(EP)及拟南芥(Arab idopsis thaliana)的甘露糖结合蛋白具有较高的序列相似性.包含B-lectin结构域的蛋白可以分成两个群,MdMBP2属于Class Ⅰ,与ClassⅡ蛋白相比,Class Ⅰ缺少SLP结构域和蛋白激酶结构域.利用荧光定量PCR技术检测MdMBP2基因的表达,发现MdMBP2基因在被检测的几种组织中均有不同程度的表达,但在皮和叶中的表达量较高,这种表达模式表明,MdMBP2可能参与多种生理途径.另外,轮纹病病原菌(Botryosphaeria dothidea)侵染能诱导MdMBP2转录本的积累,且其时序表达变化与轮纹病发病过程相关,暗示该基因参与了苹果抗轮纹病的防御反应.通过体外重组表达MdMBP2基因的重组蛋白,并用重组蛋白进行糖结合实验,发现MdMBP2蛋白能与真菌细胞壁组分高甘露糖型聚糖和甘露寡糖有较高的结合活性,表明MdMBP2蛋白可能参与病原真菌的识别.本研究分离鉴定了一个新的苹果甘露糖结合蛋白的编码基因,认为该基因参与苹果对轮纹病病原的防御反应,可能在寄主对病原的识别过程中发挥作用.     

3个澳洲坚果MYB蛋白靶基因的克隆与生物信息学分析

【目的】为阐明澳洲坚果MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)蛋白靶基因的功能及分子作用机制提供了科学的理论依据。【方法】基于澳洲坚果转录组数据和RT-PCR方法克隆澳洲坚果MYB蛋白靶基因,并利用生物信息学分析这些基因编码蛋白质的同源性、系统进化、理化性质、亚细胞定位、跨膜域和信号肽。【结果】获得了3个新的澳洲坚果MYB蛋白靶基因MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3,GenBank登录号分别为MT319120、MT319121和MT319122。MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3都包含典型结构域VHS-ENTH-ANTH,与其它植物来源的TOM蛋白具有极高的序列相似度,与荷花TOM蛋白(XP＿010260421.1、XP＿010244847.1和XP＿010260421.1)的序列相似度分别高达68.93%、75.76%和68.80%。MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3蛋白均为亲水性蛋白。MiTOM1可能定位于细胞核,为非分泌蛋白和非跨膜蛋白;MiTOM2可能定位于细胞质,为跨膜分泌蛋白;MiTOM3可能定位于细胞核或微体,为非分泌蛋白和非跨膜蛋白。蛋白二级结构预测显示,MiTOM1、MiTOM2和MiTOM3二级结构主要含有无规则卷曲和α螺旋。【结论】MiTOM1、 MiTOM2和MiTOM3包含TOM家族典型结构域VHS-ENTH-ANTH,可能在澳洲坚果体内物质运输及控制形态发育方面起重要作用。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中Fsr1基因的克隆及生物信息学分析

以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种为材料,克隆其Fsr1基因的DNA及cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。根据镰刀菌中相关基因设计简并引物,结合PCR与RT-PCR技术扩增目的片段,进行氨基酸序列推导后分析。得到结果 FoFsr1基因开放阅读框为2 474 bp,共编码824个氨基酸;FoFsr1基因编码蛋白可能是存在于细胞核中的跨膜亲水蛋白,含有54个蛋白磷酸化位点,不含有信号肽;该蛋白主要含有1个Striatin结构域及7个WD40结构域,二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其中不含有亮氨酸拉链结构;同源性分析发现其与丛赤壳菌属中的Fsr1蛋白亲缘关系最近。通过结构分析发现,推测该蛋白可能在细胞周期及细胞凋亡过程中起信号转导与转录调控的作用,从而对病原菌的致病力产生影响。     

紫云英根瘤菌种内不同菌株群体感应信号分子差异性和交互性分析

根瘤菌可以和豆科植物共生固氮,在很多根瘤菌中群体感应系统参与了结瘤固氮等相关生理过程的调节。本研究从野外不同生境紫云英宿主根部瘤体中分离了26株根瘤菌,体外定量检测了各菌株产生自体诱导物(AI)信号分子的能力,以及不同菌株AI激活中慢生华癸根瘤菌Mh菌株AHLs合成酶基因mrh I表达的情况,发现紫云英根瘤菌种内不同菌株间存在群体感应交互性。通过导入外源Att M水解酶观察菌株AI活性的变化,应用薄层层析法定性分析不同菌株的AI结构,初步揭示了不同紫云英根瘤菌产生AI特性的差异和多样性。     

十字花科黑腐病菌分泌蛋白表达谱分析

本文旨在分析Xcc8004菌株分泌蛋白的蛋白表达谱,建立Xcc8004分泌谱分析方法。首先将诱导的Xcc8004分泌蛋白进行液体酶解,通过HPLC阳离子交换柱分离多肽,采用EASY-nLC结合Orbitrap质谱鉴定分泌谱。经过过滤筛选后,共精确鉴定蛋白1532个,SignalP分析其中包含286个含信号肽且不含跨膜区,其中118个为假定蛋白。对286个可能的分泌蛋白进行基因本体评注分析,其中,主要为行驶水解酶类,受体蛋白,信号传导等重要的微生物-植物互作介导蛋白。本研究通过液相色谱-质谱联用能够高效鉴定Xcc8004的分泌蛋白,对这些鉴定的分泌蛋白的信息学分析有利于我们进一步研究Xcc8004的致病机制,为研究微生物植物相互作用鉴定了方法与理论基础。     

五指山小型猪生长激素及其受体基因的克隆与序列分析

动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程,受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中,动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下,下丘脑接受体内外的信息,生长激素释放激素(grow thhorm one releasing horm one,GHRH)和生长抑素(som atostatin,SS),调节垂体生长激素(grow thhorm one,GH)的分泌,GH通过与生长激素结合蛋白(grow th horm one b ind ing protein,GHBP)结合而运输,与靶器官上的生长激素受体(grow th horm one receptor,GHR)结合,促使类胰岛素生长因子(insu lin-like grow th factors,IGFs)的产生并进入血液循环,IGFs再通过其结合蛋白(insu lin-likegrow th factor b ind ing protein,IGFBP)转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。五指山猪(Wuzhishan Pig,WZSP)是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35 kg,是正常猪体重的15%~30%,是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征:体型小,性成熟早,肉质好,耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育,现在已经获得五指山猪近交系18代(近交系数为0.974),但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理,对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA,根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列(登录号分别为X53325,NM214254)设计特异性引物,对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增,然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明,五指山猪生长激素基因开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸,其中包含26个氨基酸的信号肽;生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸,其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist 2.2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现,五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变:26号位置发生C→T突变,该突变导致缬氨酸代替丙氨酸;65号位置发生G→A突变,该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸;114号位置发生T→C突变,252号位置发生A→G突变,但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现,1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸;1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸;1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸;1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替;1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替;1248号位置G→A突变,1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变,未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换,这两处替换发生在信号肽区,对成熟蛋白的结构和功能没有影响,但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域,这些突变可能改变生长激素受体的空间构像,从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响,影响生长激素-生长激素受体-胰岛素样生长因子轴的信号级联,削弱生长激素的促生长作用。     

植物抗旱耐盐基因的研究进展

近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析,同时通过转基因技术将这些基因转到植物中异源表达,能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力。这些基因主要包括渗透调节基因、蛋白类基因（如信号传导中的蛋白激酶基因）及转录因子等。在逆境条件下,渗透调节基因通过合成脯氨酸、甜菜碱、糖类和多胺类等渗透调节物质维持植物中的渗透平衡;蛋白激酶基因产物是细胞信号传导中的组分,这些基因能促进植物对干旱失水反应和逆境信号的传递,启动抗逆基因的表达;转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达,进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力。本文主要综述了这三类抗逆基因的研究现状及其生物学机理,讨论并分析这些基因在应用中尚待解决的问题,为发掘更多的抗逆性的基因资源和进一步开展分子育种工作提供参考。     

利用免疫共沉淀联合质谱技术筛选盐藻MAPK的互作蛋白

为进一步探究杜氏盐藻促有丝分裂原活化蛋白激酶(DsMAPK)的功能,采用免疫共沉淀联合质谱技术筛选盐藻MAPK的互作蛋白。将pGS21a-MAPK质粒转入大肠杆菌BL21中表达MAPK蛋白并制备多克隆抗体;将培养至对数生长期的盐藻细胞进行盐胁迫处理,然后提取盐藻总蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;以内源性靶蛋白为诱饵,将细胞总蛋白与MAPK抗体进行共孵育,将经蛋白A/G琼脂糖珠纯化的免疫共沉淀复合物进行质谱检测。结果表明,制备的多克隆抗体特异性良好;筛选出165种特有的差异蛋白。通过GO和KEGG分析发现,这些差异蛋白主要参与了新陈代谢、遗传信息的传递以及信号转导等生物学调控过程。蛋白质互作网络分析发现,直接与MAPK相互作用的蛋白有4种。本研究结果为深入研究杜氏盐藻响应盐胁迫的分子机制提供了参考。     

Interspecific facilitation between intercropped millets and peanuts: insights from root proteomics analysis

Intercropping is practised globally because of its advantages in terms of productivity and resource use efficiency. However, our knowledge on the molecular mechanisms underlying belowground interspecific interactions in intercropping systems is still very limited. Pot experiments involving both intercropped millet and peanut were conducted to quantify the differentially expressed proteins in each component crop under conditions of complete, partial and no interspecific interactions based on tandem mass tag (TMT) labelling. The results showed that the yields of both crops in the intercropping system increased in response to complete root interactions due to increases in nutrient acquisition as well as increases in root length and surface area. There were 73 differentially expressed proteins in the millet roots and 41 in the peanut roots, most of which were involved in C metabolism, N metabolism, transport and signal transduction. Additional bioinformatic analyses revealed that root interactions improved N and P assimilation via relatively high amounts of proteins such as urease and inorganic phosphate transporter in the millet roots and malate dehydrogenase increased P assimilation related proteins in the peanut roots. These results would contribute to a comprehensive understanding at molecular level in cereal/legume intercropping systems in response to interspecific root interactions.     

基于iTRAQ技术的不同耐热性水稻花药差异蛋白分析

为从蛋白质水平揭示耐热与热敏感水稻花药响应高温胁迫的分子机制,本研究以耐热水稻品系996和热敏感水稻品系4628为材料,采用iTRAQ技术对高温和适温条件下水稻花药进行差异蛋白质组学分析。结果表明,在996高温-996适温、4628高温-4628适温、996高温-4628高温和996适温-4628适温4个比较组中,共筛选到957个差异表达蛋白,其中上调表达蛋白398个,覆盖率达20%以上的蛋白占鉴定总蛋白的50.96%。GO分析显示,抽穗开花期花药差异蛋白主要集中于代谢过程和细胞过程,在细胞组成方面主要分布于胞内部分、细胞器和细胞,分子功能主要涉及催化活性、绑定等。花药差异蛋白通路分析显示,来源于bZIP和DOF家族的2个转录因子差异表达,DOF家族基因上调,bZIP家族基因下调;18个HSPs基因中大部分表达上调;与植物激素和信号传导相关基因大部分表达下调;10个活性氧(ROS)相关基因中5个表现为上调;与次生代谢相关基因大部分下调。本研究结果为揭示水稻花药高温胁迫的应答分子调控机制提供了一定的理论基础。