水稻条斑病菌的hpal和hpaB基因控制水稻的致病性,但不决定烟草的过敏反应

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)的hrp基因簇编码Ⅲ型分泌系统(T3SS),将致病性效应分子注入寄主细胞中,决定在寄主水稻(Oryza sativa)的致病性(pathogenicity) 和在非寄主烟草(Nicotiana benthamiana)的过敏性反应(hypersensitive response,HR).Hpa1可在烟草上激发HR,HpaB是T3SS的出口控制蛋白.为了解Hpa1与HpaB是否共同决定病菌Xoc在烟草上的HR以及在水稻上的致病性,本研究通过基因敲除方式分别获得了hpa1和hpaB的单突变体以及hpa1hpaB双突变体.致病性测定结果显示,hpa1突变体在水稻上的毒性减弱,在烟草上仍能激发HR;hpaB单突变体以及hpa1和hpaB双突变体在烟草上仍能激发HR,但对水稻无致病性.这暗示,水稻条斑病菌除Hpa1外,还存在不依赖HpaB分泌的未知Harpin蛋白.免疫杂交结果显示,hpaB突变后,效应分子XopQxoc不能通过T3SS进行分泌.这提示,HpaB控制了T3SS效应分子的分泌,从而决定Xoc对水稻的致病性.这些结果为进一步发掘水稻黄单胞菌中的未知Harpin蛋白以及分析依赖或不依赖HpaB进行分泌的T3SS效应分子与水稻的互作关系,提供了科学线索.     

一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控hrpX基因的报告质粒的构建

过敏性反应与致病性基因(hrp)所编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的决定性致病因子。在黄单胞菌属中,HrpG是目前已知的hrp基因表达的最高层面的调节蛋白,至今尚未鉴定到野油菜黄单胞菌调控hrpG表达的基因。本研究利用hrpX启动子和蔗糖敏感型sacB基因构建了hrpX表达报告质粒。实验结果表明该报告质粒可用于筛选鉴定正向调控野油菜黄单胞菌hrpX表达的基因。该报告质粒的构建,为研究hrp基因表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制提供了有效的材料。     

植物病原细菌hrp基因研究进展

ｈｒｐ基因是一类决定病原细菌对寄主植物的致病性和在非寄主植物上激发过敏性反应的基因。由于它在寄主致病和非寄主抗病中的双重功能，使得ｈｒｐ基因的研究成为植物病原菌和植物互作研究领域中的一个重要内容。ｈｒｐ基因在植物病原细菌中的广泛存在及高度同源性说明不同植物细菌病害中存在着共同的机制。本文就植物病原细菌中ｈｒｐ基因的分布、特征、同源性、ｈｒｐ基因表达调控以及ｈｒｐ基因产物和功能等方面研究进展做一综述     

西瓜噬酸菌吡哆醛磷酸(VB6)营养缺陷型与致病性相关

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起的一种病害,严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实,造成大量减产.迄今,对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面,而对病原菌的致病机理仍然知之甚少.本实验以西瓜噬酸菌xjl12菌株为背景构建转座子(mini-Tn5)插入的突变体文库,以哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)为实验材料,通过对哈密瓜种子浸种处理和子叶注射接种的方法筛选突变体,而后利用同源重组的方法获得插入突变体,并对所得的突变株及野生型、互补等各个菌株进行致病性、游动性等相关表型进行测定.研究结果表明,通过文库筛选得到的1株致病力明显下降的突变体,亚克隆鉴定可知该突变体△xj-25的Mini-Tn5插入位点为吡哆醛磷酸生物合成蛋白基因(pdxJ基因),其功能主要与吡哆醛磷酸(俗称VB6)生物合成蛋白相关.突变菌株△Pdx.J致病性显著下降,生长能力、游动性明显降低,无法正常形成鞭毛和产生生物膜.通过外源添加VB6可恢复其致病性和生长能力等主要表型.本研究证明VB6生物合成在致病性、生长能力以及鞭毛的合成等方面发挥着重要作用,为降低病原菌侵害提供了一个新的思路.     

西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛相关基因pilO及pilQ的功能分析

瓜类细菌性果斑病是发生在葫芦科植物上的一种病害,其病原为噬酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli),自报道以来已给美国、澳大利亚、巴西、中国等众多国家的瓜类作物种植业造成了严重的损失。要从根本上防治瓜类细菌性果斑病,我们应弄清其致病机制。本实验对西瓜噬酸菌(A.citrulli)中部分Ⅳ型菌毛(pili)相关基因构建插入突变体,用浸种测定法筛选出两株致病力和发病率明显减弱的突变体,鉴定为pilO及pilQ基因突变体,并对这两株突变体的相关表型进行测定。在透射电子显微镜下观测发现,野生型及pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛,而pilQ基因突变体丧失形成Ⅳ型菌毛的能力;光学显微镜下观测野生型、突变体及互补菌株的颤动能力发现,pilO及pilQ基因突变体与野生型相比,完全丧失颤动能力;同时pilO及pilQ基因突变体游动能力、生物膜形成能力也明显减弱。互补菌株中,颤动能力得到恢复,致病力、游动能力以及生物膜形成能力部分恢复。在MMX基本培养基中测定野生型与突变体的生长曲线发现,突变体菌株生长能力无明显改变;同时突变体也能激发非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应。pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛但丧失部分Ⅳ型菌毛介导的功能,由此表明,pilO基因并不直接参与西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛的合成,而是Ⅳ型菌毛的功能基因;pilQ基因突变体不能形成Ⅳ型菌毛且丧失其介导的部分功能表明,pilQ基因在西瓜噬酸菌中直接参与Ⅳ型菌毛的合成,是Ⅳ型菌毛的合成及功能基因。同时也进一步证明西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛与其颤动性、致病性、游动性及生物膜形成能力相关。     

瓜类细菌性果斑病菌hpaP基因的功能分析

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用.     

野油菜黄单胞菌hpa2基因的突变和功能分析

利用自杀质粒pK18mob诱变野油菜黄单胞菌Xcc8004的hpa2基因,获得整合突变体PK3001。致病性和过敏反应检测发现,hpa2突变体PK3001过敏反应完全丧失,但致病性无明显变化。利用gus报告基因和RT-PCR检测hpa2基因的表达调控,结果表明,hpa2基因在基本培养基上高表达,且受hrpG、hrpX正向调控。     

梨火疫菌(Erwinia amylovora)环腺苷酸受体蛋白基因(crp)的功能分析

梨火疫菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科(Rosaceae)植物的火疫病.在菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)中,由crp基因编码的环腺苷酸受体蛋白(cyclic adenosine monphosphate(cAMP)receptor protein,CRP)对果胶酶基因的表达调控和菌株致病性起着重要的作用.本研究首次鉴定并克隆出梨火疫菌中的crp同源基因,命名为Eacrp,并通过同源重组的方法,构建了梨火疫菌的crp基因突变体Ea△crp以及互补子,进行了致病性、过敏性反应、胞外多糖、鞭毛运动等一系列相关表型的鉴定.结果表明,crp基因影响着梨火疫菌的致病性、胞外多糖、游动性、生长情况等多种生物学特性,然而,Ea△crp仍能引起烟草过敏性反应,并且在过氧化氢敏感度以及沉降性、生物膜和AI-2信号分子的生成方面与野生型菌株相比差异明显.本研究结果说明,梨火疫菌crp基因对病菌的胞外多糖分泌、生长、游动性以及致病性方面具有关键作用.     

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)双精氨酸运输系统基因(tatC)的功能分析

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科植物的火疫病.双精氨酸运输系统(Tat)与致病相关蛋白的转运有特定的联系.本研究在梨火疫病菌全基因组中发现了同源基因,通过同源重组的方法,构建了梨火疫病菌的tatC基因突变体以及互补子.研究结果表明,tatC基因影响着梨火疫病菌的致病性、胞外多糖、鞭毛运动、游动性、趋化性、生长情况等多种生物学特性.然而,Ea△tatC仍能引起烟草过敏性反应,并且在胞外纤维素和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异.说明梨火疫病菌tatC基因对病菌的生长、游动性以及致病性方面具有关键作用.     

十字花科黑腐病菌hrpG基因原核表达

在十字花科黑腐病菌（Xcc）中,hrp基因对寄主的致病性和非寄主的超敏反应中起核心作用,而hrpG对整个hrp基因簇起调控作用。HrpG为OmpR家族的双组分系统感受调控蛋白,含有两个结构域,分别是N端Response_reg和C端Trans reg_C。本研究利用表达载体pQE-30Xa,成功构建了HrpG的表达重组子,在E.coliM15[pREP4]中进行诱导表达。通过调节诱导温度、IPTG浓度和诱导时间最终确定在温度为20℃,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。hrpG基因在宿主细胞E.coli M15获得高效可溶性表达。目前尚未有可溶性HrpG蛋白获得成功表达的报导,本研究中获得HrpG蛋白在大肠杆菌获得大量可溶性的表达,将为in vitro研究HrpG的生理活性,特异的结合位点和调控功能研究打下良好基础。     

水稻白叶枯病菌蛋白质激发子HarpinXoo诱导植物的防卫反应

摘要：含质粒pHRF4的表达菌株BLHR4在培养基中经IPTG诱导，16 h Harpin表达接近最高量。用不同浓度的HarpinXoo喷雾处理烟草(Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassica campestris L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)，对烟草花叶病毒(TMV)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum (lib.) de Bary)和番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)均表现较好的诱导抗病效果。以浓度为100μg/mL的HarpinXoo处理烟草后，分别测定叶片中与防卫反应相关的一些生理指标的变化，结果表明，处理叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（PO）和多酚氧化酶（PPO）活性都有不同程度的增强。三种酶活性高峰分别在处理后24、12和3 h出现，分别比清水对照增加110.1%、211.2%和273.0%；同时，两个病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因PR-1b和PR-1a在HarpinXoo处理24 h后被诱导显著表达，36 h时达到最高表达水平。这表明HarpinXoo与HarpinEa一样能够诱导烟草不同抗病信号通路的启动，从而使植株获得抗病性。     

产过敏素的耐氨固氮工程菌的构建

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)E26(pMC73A）是带有耐氨质粒的固氮工程菌。本研究通过三亲杂交的方法将带有梨火疫病菌hrp基因簇的重组粘粒pCPP430导入E26(pMC73A)。接合子在番茄叶片上出现也对照DH5（pCPP430）一样典型的过敏反应症状，而出发菌E26(pMC73A)测 没有过敏反应；从接合子抽提到2条质粒DNA带，一条与pCPP430位置相同，大小约50kb，另一条与pMC73A位置相同，大小约7kb；接合子质粒DNA的酶切图谱正好是pCPP430和pMC73A酶切图谱的叠加；用地高辛标亡的hrpN DNA上进行Southerm hybridization分析，在接合子的质粒酶切产物中得到预期的杂交带，而出发菌E26（pMC73A）无任何杂交信号。通过质粒抽提、酶切验证、Southern hybridization分析以及在番茄叶片上的过敏反应测定、均表明生产植物抗性诱导蛋白的耐氨固氮工程菌构建成功。     

致病菌基因组岛的研究进展

细菌基因组岛是细菌基因组上的特定区域,和水平基因转移相关,具有一定的结构特点,常携带致病、耐药及与适应性等功能相关的基因。通过基因组岛在细菌间的移动,可以造成相关基因在细菌间的传播,在细菌生存和致病等过程中具有重要作用。目前已经可通过生物信息和分子生物学实验等方法对基因组岛进行预测和验证。通过对致病菌基因组岛的研究,可以阐释细菌致病性和耐药等重要功能的获得,对疾病进行溯源,在传染病预防控制中具有重要意义。     

Involvement of programmed cell death in suppression of the number of root nodules formed in soybean induced by Bradyrhizobium infection

Legumes establish symbiosis with nitrogen-fixing rhizobia through root nodules to acquire nitrogen. Legumes control nodule number through systemic (autoregulation of nodulation) as well as local regulation. Moreover, plants defend themselves against bacteria and other pathogens through the induction of localized (localized acquired resistance) and systemic (SAR, systemic acquired resistance; ISR, induced systemic resistance) responses. Herein, we show that the number of root nodules is suppressed by programmed cell death (PCD), and is simultaneously controlled by SAR and ISR in soybean (Glycine max [L.] Merr.). The wild-type soybean cultivar Williams 82 showed markedly fewer root nodule primordia and PCD symptoms, including accelerated DNA degradation, enhanced generation of reactive oxygen species (visualized by 3,3′-diaminobenzidine staining), and excessive cell death (detected on staining with trypan blue) compared to the hypernodulation mutant NOD1-3. These results suggest that PCD suppresses the formation of root nodules in wild-type soybean. In addition, microarray and gene ontology analyses showed that essential components of hypersensitive response (HR) or disease resistance, such as resistance (R) genes, mitogen-activated protein kinase cascade, SAR, salicylic acid, jasmonic acid, ethylene, etc., were activated in wild-type plants. These analyses corroborate the above findings, demonstrating that the suppression of root nodule formation by PCD is accompanied by HR, and is simultaneously controlled by SAR and ISR in soybean. These findings provide new insight into the control of nodulation to balance nutritional requirements and energy status in legumes.     

十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因hpaS的XC_2486基因鉴定

十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。     

过路黄叶斑病病原鉴定及拮抗细菌的筛选

为明确贵州省施秉县过路黄叶斑病的病原种类,探索该病害的生物防治方法,本试验利用组织分离法、致病性测定法获得致病菌株GLHYB,并结合形态学特征和基于内转录间隔(ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)、延伸因子(EF-1α)3个基因构建系统发育树,将该菌株鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani).利用组织...