玉米纹枯病菌侵染的病理学观察及基因组甲基化敏感扩增多态性分析

植物基因组DNA甲基化的变化是调节基因功能的重要手段,是生物体应对各种胁迫的表观遗传反应.本研究对玉米(Zea mays)高耐纹枯病材料R15和高感纹枯病材料478进行人工接种纹枯病病菌(Rhizoctonia solani Kühn),利用扫描电镜及数码拍照技术观察病菌侵染自交系R15的病理学变化,结果显示,菌丝主要通过叶鞘部位气孔进行侵染,病斑大小的变化表明病菌对寄主的侵染具有一定的梯度性;利用基因组甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,采用24对选择性扩增引物对两个抗性不同玉米材料接菌0、6、12和24 h的DNA甲基化模式进行分析,结果显示,两个材料中半甲基化水平均呈上升趋势,且R15变化幅度较大,全甲基化水平呈现先上升后下降的趋势.本研究表明,DNA甲基化与玉米纹枯病抗性反应密切相关,在抗性反应调节系统中可能起重要的作用.     

镉胁迫下二倍体和同源四倍体油菜DNA甲基化差异分析

二倍体与四倍体在逆境抗性上的差别可以从表观遗传学的角度予以解释。本研究以“矮脚黄”纯合二倍体和同源四倍体油菜为材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性分析（Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP）方法和HDA-GT12TM全自动凝胶毛细管核酸电泳检测技术,在全基因组水平上研究了CdCl2胁迫下油菜二倍体和四倍体DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征差异。采用56对引物在4个处理样品中共检测出9 687个基因位点。结果显示,二倍体和四倍体在镉胁迫下,其总甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平较各自的对照均有一定程度的上升。由此可见,镉胁迫导致四倍体和二倍体甲基化水平的提高,但四倍体基因组在镉胁迫下拥有更高的DNA甲基化水平。DNA甲基化模式分析表明,镉胁迫导致二倍体和四倍体的过甲基化位点数均高于去甲基化位点数,二者在镉胁迫下去甲基化位点数差异不大,但四倍体发生过甲基化的位点数要明显多于二倍体。     

盐胁迫诱导玉米苗期DNA甲基化变异的研究

为研究不同浓度盐处理下玉米叶片DNA甲基化情况,以耐盐玉米自交系黑玉米为材料,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,分析不同盐浓度胁迫7 d后,玉米苗期叶片胞嘧啶甲基化水平和模式的变化。结果表明,经0(CK)、50、100、150、200、250 mmol·L~(-1)NaCl处理后,基因组DNA甲基化比率分别为52.79%、57.47%、51.98%、47.39%、49.16%、47.06%,其中只有50 mmol·L~(-1)NaCl处理高于CK,其他处理呈降低趋势,去甲基化变化幅度相对较大(1.8%~12.2%);回收差异片段后测序并对序列进行同源比对,结果发现16个甲基化位点涉及植物生长发育的多个基因。本研究结果为玉米耐盐机理的深入研究提供了一定的依据。     

重金属镉胁迫下入侵植物黄顶菊表观遗传变异特征

为探究入侵植物黄顶菊在重金属镉(Cd)胁迫下耐受性获得的表观遗传机制,本研究通过网室盆栽试验模拟不同浓度Cd污染生境,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对不同Cd浓度胁迫[0(CK)、2(Cd-1)、4(Cd-2)和8(Cd-3) mg·kg^-1]处理植物叶片基因组DNA甲基化变异特征进行分析。结果表明,15对引物共扩增出726条甲基化条带,且引物多态性百分比为84.75%;随着Cd胁迫浓度的升高,黄顶菊叶片全甲基化和整体甲基化发生比例呈逐渐增加的趋势,Cd-1、Cd-2和Cd-3的全甲基化发生比例分别为CK的1.51、1.95和2.11倍,整体甲基化发生比例分别较CK升高了39.28、53.30和63.97个百分点;不同处理下叶片甲基化状态变化分析结果表明,Cd胁迫下黄顶菊基因组DNA重新甲基化和去甲基化2种甲基化模式均有发生,但以重新甲基化类型为主要变化模式;Cd胁迫下植物表型可塑性与表观遗传相关性分析结果表明,DNA全甲基化和整体甲基化水平与黄顶菊生长指标及地上部耐受性指数的表型可塑性呈显著负相关,与抗氧化酶活性、各组织Cd含量及富集与转移系数呈显著正相关。本研究结果从表观遗传学方向为入侵植物黄顶菊的防控提供了新思路。     

PEG模拟干旱胁迫对石斛DNA表观遗传变化的MSAP分析

利用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术,研究不同聚乙二醇(PEG-6000)处理浓度下霍山石斛基因组DNA的甲基化水平和变化模式.结果表明:经5%、10%和15%PEG-6000处理的霍山石斛DNA甲基化比率分别为34....     

紫玉米籽粒呈色过程中DNA甲基化变化的MSAP分析

为了研究紫玉米籽粒呈色的分子机制,本研究以鲜食紫玉米自交系为材料,采用甲基化敏感扩增多态性技术,分析紫玉米籽粒生长发育过程中,呈色组织DNA甲基化水平和模式的变化。试验结果表明,紫玉米籽粒在授粉10d至40d的发育过程中,DNA半甲基化条带比率与全甲基化条带比率均随着籽粒的生长发育而逐渐升高,在授粉后10、20、30、40d,半甲基化条带比率分别达到8.12%、8.25%、8.90%和9.83%,全甲基化条带比率分别达到17.24%、17.76%、17.93%和18.14%。通过对甲基化表现呈多态性变化的8个片段回收、测序分析表明,DNA甲基化发生的位点既存在于基因组的编码区,也存在于非编码区。本研究为探讨紫玉米籽粒发育及其色素积累的分子机制提供参考依据。     

不同单株叶籽银杏DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

以叶籽银杏和普通银杏叶片为试材,利用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于叶籽银杏全基因组的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,在全基因组水平对11株叶籽银杏和1株正常银杏的胞嘧啶甲基化水平和模式进行评估。结果表明,从36对MSAP选扩引物中,选出14对MSAP引物组合,共扩增产生2766条清晰可辨且可重复的DNA条带,产生3种类型的甲基化条带。在全部扩增位点中,检测到叶籽银杏基因组CCGG序列的甲基化比率为26.42%～65.79%,正常银杏总甲基化率达30.79%,不同单株的叶籽银杏平均总甲基化率达38.61%,叶籽银杏甲基化事件的发生频率为11.27%～27.34%。方差分析显示不同单株间DNA甲基化水平差异极显著。主成分分析绘制的主分量散点图与聚类分析结果一致,不同单株的叶籽银杏可分为3大类。     

重离子辐射诱导水稻DNA甲基化变化的分析

为了研究不同剂量重离子辐射对植物产生的表观遗传学效应规律,采用2种不同的高传能线密度和不同剂量(0、0.2、2Gy)的12C6+放射流辐照干燥的水稻种子,分别选取辐射水稻三叶期及分蘖期的叶片,通过甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)进行CCGG位点的甲基化状态分析。结果表明,重离子辐射,尤其是高剂量的辐射明显造成水稻DNA甲基化的多态性水平的变化,其中DNA去甲基化的多态性水平明显高于DNA甲基化的多态性水平,且DNA甲基化位点更倾向于CNG。此外,利用全基因组甲基化测序进一步验证了重离子辐射对水稻DNA甲基化的影响。本研究结果为探讨空间辐射引起水稻表观遗传变化的分子机制提供了重要的理论依据。     

小麦杀配子染色体单体附加系CS-2C的DNA甲基化变异分析

本研究利用MSAP方法检测普通小麦中国春(CS)、中国春-杀配子染色体2C单体附加系(CS-2C单体附加系)的DNA甲基化变异,探究DNA甲基化与杀配子染色体的关系。结果表明,CS-2C单体附加系5'-CCGG位点的胞嘧啶甲基化水平(45.33%)高于CS(40.35%),其中全甲基化率与半甲基化率均有所升高。与CS相比,CS-2C单体附加系的5'-CCGG位点发生了明显的胞嘧啶甲基化模式变异,以胞嘧啶甲基化升高为主,其中CG位点甲基化变异幅度高于CHG位点甲基化变异幅度。通过对甲基化差异片段进行测序鉴定,结果显示部分差异片段与普通小麦Sukkula-like转座子等具有高度同源性。由此推测,转座子可能在杀配子作用机制中起作用。本研究为揭示杀配子染色体的分子机制奠定了基础。     

不同甘蔗品种DNA甲基化分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,在基因表达调控中发挥着重要的作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,在全基因组水平上研究不同品种甘蔗伸长期和成熟期CCGG位点的DNA甲基化水平及模式变化特征。结果表明,在伸长期,8个甘蔗品种检测到的DNA甲基化率为15.47%~29.03%;引物平均甲基化率为28.86%。在成熟期5个甘蔗品种中检测到的DNA甲基化为6.98%~14.94%。表明DNA甲基化在甘蔗中发生频繁,且品种之间的甲基化模式存在差异,甘蔗CCGG序列中胞嘧啶甲基化内侧胞嘧啶全甲基化多于外部胞嘧啶半甲基化。     

猪个体DNA甲基化百分差异与胴体性状的关系

以77头大白×梅山猪杂交F1代3月龄血液样DNA为材料,应用甲基化敏感扩增多态技术(MSAP),研究了胴体性状的影响因素.从个体全部甲基化百分差异、个体中性甲基化百分差异和个体特殊甲基化百分差异3个层次分析了其对胴体性状的影响.15个胴体性状在个体中性甲基化百分差异水平之间均无显著的差异(P＞0.05);内脂率、瘦肉率和瘦肥肉比例在个体全部甲基化百分差异水平之间存在显著的差异(P＜0.05);胴体重、内脂率、肩部最厚处背膘厚、平均臀部背膘厚、平均背膘厚、至第一肋胸胴体长和骨率在个体特殊甲基化百分差异水平之间存在显著的差异(P＜0.05).胴体性状变化规律归纳为3大类型(1)性状值随个体特殊甲基化百分差异的增加而上升;(2)性状值随个体特殊甲基化百分差异的增加而下降;(3)性状值随个体特殊甲基化百分差异的增加而波动.回归分析表明,内脂率、肩部最厚处背膘厚、平均臀部背膘厚和平均背膘厚与个体甲基化百分差异回归关系显著(P＜0.05).研究揭示,DNA甲基化可以作为分子标记用于相关的研究;显著影响性状表现的甲基化位点在杂种优势预测中要优于其它甲基化位点;在生产实践中,应针对不同性状保持杂交后代适当的甲基化差异水平,以提高生产水平.     

乙烯利处理对棉花子叶DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

棉花(Gossypium hirsutum L.)叶片早衰影响棉花产量和棉纤维质量,而乙烯利是一种重要的植物生长调节剂,对促进植物组织衰老有重要作用。DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在高等植物的基因表达调控中发挥了重要作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,探讨在不同乙烯利水平处理下,棉花子叶DNA甲基化水平和甲基化变化模式。结果显示,经300、500和700 mg/L乙烯利处理后,棉花子叶DNA甲基化比值分别为32.99%、35.45%和37.49%,都低于对照组(37.92%);和对照组相比,经不同浓度乙烯利处理后,棉花子叶DNA发生甲基化变化位点的比率分别是2.71%、3.63%和4.88%,而去甲基化位点的比率分别为10.66%、9.84%和9.23%,并且随着乙烯利浓度的增加,棉花子叶DNA甲基化位点与去甲基化位点之比逐渐提高;本研究鉴定了17个MSAP差异基因片段,这些片段与NCBI中已知的功能基因存在同源性,包括果胶甲酯酶基因、细胞色素P450、乙醇脱氢酶基因、肌动蛋白解聚因子、翻译延伸因子等和乙烯利诱导棉花子叶衰老相关基因。研究结果提示,在乙烯诱导棉花子叶衰老的进程中,DNA甲基化参与了棉花子叶衰老的调控,为从基因组水平上揭示乙烯诱导棉花衰老的调控机制提供理论依据。     

不同氮水平对原产地和入侵地飞机草(Chromolaena odorata L.)DNA甲基化的影响

为探究原产地和入侵地飞机草DNA甲基化多态性的变化和氮营养水平对飞机草DNA甲基化多态性的影响,本文用水培法分别培养来自原产地墨西哥和入侵地西双版纳的飞机草(Chromolaena odorata L.),对两地飞机草进行了高氮(315 mg·L-1)、正常(中)氮(210 mg·L-1)和低氮(105 mg·L-1)3种氮水平处理,采用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)技术测定试材的DNA甲基化水平。结果表明,无论是原产地还是入侵地的飞机草,在高氮和低氮处理条件下均发生了DNA甲基化水平和模式的改变;且入侵地飞机草DNA甲基化水平高于原产地飞机草,飞机草DNA甲基化水平都随着氮供应水平的升高而升高。本研究为从表观遗传角度揭示外来植物的入侵机制提供依据。     

低温解除牡丹休眠进程中基因组DNA甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在真核生物的基因表达调控中发挥了重要作用。本实验研究了感受0、6、12、18和24d4℃低温的牡丹(Paeonia suffruticosa)鲁荷红移入温室后的萌动和开花表现,并对其进行了甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析。结果表明,4℃低温处理18d可解除鲁荷红内休眠,继续增加低温则进入生态休眠阶段。MASP分析表明,牡丹内休眠期间花芽内DNA甲基化程度很高,甲基化位点占总位点比率的60%以上,以半甲基化为主,在低温处理进程中,甲基化水平总体呈下降趋势。与未经低温的对照相比,约50%的位点发生了甲基化模式变化,低温6、12、18和24d去甲基化位点数和比例分别为97(17.1%)、104(18.6%)、148(24.6%)和218(36.1%),过甲基化的位点数分别为197(34.7%)、137(24.6%)、95(15.8%)和79(13.1%)。研究结果提示,DNA甲基化参与了牡丹内休眠的调控。     

二倍体和同源四倍体西瓜的DNA甲基化差异分析

为了解植物不同倍性之间的表现遗传差异,对3个西瓜（Citrullus lanatus）品种克西、中金和枚选的纯合二倍体和同源四倍体进行甲基敏感扩增多态性（MSAP）分析,10对引物共扩增546条带,其中,二倍体较同源四倍体材料之间有3条特异性条带,这些特异性条带无品种差异,系倍性不同所致。带型变化表明,同源四倍体较二倍体有DNA甲基化减少和单链增加现象,但从DNA甲基敏感多态性差异上来看,品种内二倍体和同源四倍体间的DNA甲基敏感多态性差异不大,仅0.02%左右。     

超低温小麦种子和幼苗保存及遗传变异分析

 以小麦（Triticum aestivum L.）品种周98165和开18的种子与幼苗为材料,对它们超低温（液氨中）保存前后的发芽和成活率及田间生长指标进行了研究,并采用AFLP和MSAP技术对其遗传稳定性作了初步探讨。结果表明,小麦种子经超低温保存后,其发芽率和成活率与对照相比有一定的差异,但田间生长,除分蘖数稍低于对照外,其他生长指标与对照相比没有明显区别。而超低温保存后的幼苗,各项生长指标与对照均有显著差异。AFLP技术分析了超低温保存前后的样品,同一品种不同处理间的AFLP带型一致,统计的1500多条带中未见明显差异带型,表明在超低温保存前后无论是种子还是幼苗,其基因组DNA序列均没有发生变异。进一步用MSAP技术分析了超低温保存后的样品的甲基化水平,13对引物共扩增出590多条清晰的带,与对照相比,超低温保存后的材料均产生了不同程度的甲基化变化。其中变异带最多的达83条,变异率高达13.67%,且脱甲基化变化是主要趋势。     

高山马铃薯脱毒苗DNA甲基化的MSAP分析

为了解脱毒对高山马铃薯试管苗DNA甲基化水平的影响,探究DNA 甲基化在高山马铃薯脱毒后的作用,结合毛细管电泳检测技术对怀玉山高山马铃薯脱毒苗的基因组DNA甲基化进行MSAP分析。结果表明,怀玉山高山马铃薯常温继代带毒苗甲基化水平较高,经过玻璃化法超低温保存处理但未能脱毒时其甲基化水平有所下降,但甲基化仍处于较高水平,而常规茎尖培养脱毒和玻璃化法超低温疗法脱毒可明显降低试管苗的甲基化水平,且玻璃化法超低温疗法脱毒苗的甲基化水平更低。在怀玉山高山马铃薯超低温保存(未能脱毒)、茎尖常规培养脱毒和超低温疗法脱毒3个处理方式中,去甲基化模式和甲基化模式并存,但均以去甲基化模式为主要趋势,且在去甲基化模式的强弱依次为超低温疗法脱毒>茎尖常规培养脱毒>超低温保存(未脱毒)。本研究结果为怀玉山高山马铃薯脱毒苗的种质保存和规模化生产提供了一定的理论依据。     

不同动物部分组织基因组甲基化程度的差异分析

应用甲基敏感扩增多态性(MSAP)技术,检测和分析了猪、牛、羊、小鼠、鸡和鸭基因组的甲基化程度。结果表明,对CCGG位点,实验中检测的几种动物的甲基化程度多数在0.40￣0.50之间(不包括牛);不同动物来源相同组织基因组的甲基化程度不同,相同动物不同组织基因组的甲基化模式具有特异性;同一种动物,组织基因组的甲基化程度一般都高于血液基因组;另外,哺乳动物与禽类基因组甲基化程度未发现较大的差别,但哺乳动物基因组全甲基化位点较多,半甲基化位点较少。     

~(60)Co-γ射线诱导的小麦基因组DNA的甲基化变异

诱发突变技术在小麦品种改良中具有重要作用,辐射诱变能通过改变DNA甲基化的方式而影响基因组稳定性。本研究分别采用100和150Gy60Co-γ射线处理小麦品种京411(J411)干种子,利用甲基化敏感扩增多态性技术检测处理后幼根和幼叶基因组甲基化相对水平的变化及甲基化模式的变异规律。结果表明,γ射线处理对幼苗的苗高和根长都有显著抑制作用。与未处理对照比较,处理后小麦幼苗叶片和根部DNA胞嘧啶甲基化相对水平均发生变化,叶片的甲基化相对水平下降,而根中升高。2种处理剂量下,叶片和根的甲基化模式变异均表现为CG位点变化率高于CNG位点变化率。不同位点的甲基化模式变异在诱变后也存在一定的差异。叶片中不同剂量下CG位点和CNG位点的去甲基化率都高于相应位点的甲基化率;根部CNG位点在所有剂量下的去甲基化率都低于相应位点的甲基化率,而CG位点在100Gy剂量下去甲基化率高于相应位点的甲基化率,而在150Gy剂量下的去甲基化率则低于相应位点的甲基化率,反映出同一组织同一位点在不同诱变剂量处理下甲基化模式变异存在一定的差异。     

入侵植物黄顶菊不同器官和不同发育阶段DNA表观遗传多样性变化特征

DNA甲基化是植物DNA普遍存在的一种表观遗传修饰方式,不仅在植物快速适应新环境中发挥重要的作用,还参与植物生长发育和器官分化特异性过程。本研究通过构建优化的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)体系来分析入侵植物黄顶菊不同器官和同一器官不同发育阶段的组织甲基化变异特征。结果表明:器官特异性MSAP体系利用筛选的13对引物共扩增536条条带,其中引物EhHM7对表观遗传多样性贡献率最大,多态性百分比为92.45%;发育阶段特异性MSAP体系利用筛选的14对引物共扩增407条条带,其中EcHM1对表观遗传多样性贡献率最大,多态性百分比为80.56%。甲基化类型变异结果显示,黄顶菊不同器官(根、茎和叶)间以及同一器官不同发育阶段(老叶和嫩叶)的组织间均表现出显著的甲基化水平差异性,半甲基化、全甲基化和整体甲基化三种甲基化变异类型中茎组织的甲基化发生率最高,分别达到30.28%、19.37%甲基化率显著高于嫩叶组织,分别达到33.29%密集,且嫩叶较老叶密集,表明根个体间和茎个体间均存在较大的差异,这种个体差异大于黄顶菊叶片的个体间差异,且老叶的个体差异大于嫩叶,这种个体间差异在样品采集时不可忽视。所以,在利用表观遗传学方法进行黄顶菊入侵性的研究中,必须要制定科学的采样方案,把植物器官和生长发育阶段特异性作为一个重要因素考虑在内。