农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。     

根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得

为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养时间等,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明,“早红”草莓适宜的转化条件是：外植体的最适预培养时间为2～3 d,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为OD600 0.3～0.5,最适侵染时间为15 min,最适共培养时间为3 d。在此基础上,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N -乙酰转移酶（AANAT）和羟吲哚-氧甲基转移酶（HIOMT）基因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southern blot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。     

节瓜CqWRKY1基因的遗传转化

为建立和优化节瓜的遗传转化体系,并高效地完成CqWRKY1基因的遗传转化,本研究以节瓜A39为材料,通过RT-PCR技术克隆了节瓜CqWRKY1基因,采用Gateway同源重组法构建了pEarleyGate101-CqWRKY1超表达载体,以节瓜子叶节为外植体,利用农杆菌介导的遗传转化法进行转化。结果表明,子叶节不定芽诱导的最适培养基为MS+0.5 mg·L~(-1)6-BA+1 mg·L~(-1)ABA,诱导率可达76.17%;生根的最佳培养基为1/2MS+0.5 mg·L~(-1)IAA;农杆菌侵染的最佳条件为农杆菌浓度OD_(600)为0.3、侵染时间为10 min、共培养时间为3 d;最佳的抑菌抗生素为500 mg·L~(-1)的头孢霉素。本研究在181株拟转基因组培苗中共得到76株阳性T_0转基因组培苗,其中共有37株移栽成活。PCR结果表明,CqWRKY1已成功整合到37株转化植株的基因组中。本研究结果为进一步研究CqWRKY1基因的功能奠定了一定的理论基础。     

爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化

以爬行卫矛(Euonymus fortunci var.radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株.结果表明,0.5 mg/LBAP和0.01 mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个.将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中.遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率.     

爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化研究

以爬行卫矛(Euonymus fortunei var. radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明,0.5mg/L BAP和0.01mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个。将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404, 通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。     

农杆菌介导的大豆成熟胚芽尖遗传转化体系的优化

以大豆品种‘浙春3号’的胚芽尖为受体材料,利用农杆菌介导法转化抗逆相关大豆转录因子GmGT-2A,为探讨过量表达该基因以提高大豆对非生物胁迫的抗逆性准备材料,通过研究预培养时间、共培养培养基的6-BA浓度、侵染时间等因子对转化效率的影响,系统优化了大豆的成熟胚芽尖转化体系。单因素优化实验结果表明：预培养时间、6-BA浓...     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化体系的建立

采用携带gus和hpt基因双元表达载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105对向日葵（Helianthus annuus）品种新葵杂6号的茎尖分生组织进行遗传转化,以共培养后7 d外植体的gus基因纯合表达频率为指标测定转化率.结果表明,潮霉素适宜的筛选浓度为10mg/L,根癌农杆菌侵染浓度OD600=0.8,果胶酶（0.05%）与纤维素酶（0.1%）共同消化外植体30 min,共培养温度24℃,共培养培养基中添加乙酰丁香酮（ACS）100μmol/L,向日葵茎尖gus基因纯合表达率高达32.8%.对抗性苗进行PCR和Southern blot检测,初步证明T-DNA上的hpt基因已整合向日葵的基因组中.     

农杆菌介导陆地棉棕彩选1号茎尖遗传转化

为建立高效的棕色棉茎尖遗传转化体系,以陆地棉棕彩选1号为材料,采用农杆菌介导茎尖的遗传转化方法,以培养7 d的棕彩选1号幼苗茎尖为受体,设计正交试验对共培养时间、共培养温度、菌液OD600、侵染时间等条件进行优化;此外,还研究了受体茎尖的大小及真空渗透等因素对转化效率的影响,初步建立了棕色棉茎尖农杆菌介导的遗传转化技术体系。结果表明,带有0.5 cm下胚轴的茎尖适合转化,适宜的农杆菌介导遗传转化条件为农杆菌菌液浓度OD600=1.0,侵染时间20 min,共培养时间3 d,共培养温度24℃。此外,真空渗透处理有助于抗性苗的发生。再生植株经在含100 mg·L~(-1)卡那霉素的培养基上筛选,获得102株抗性植株,再进行PCR鉴定和Southern杂交检测,共获得24株转基因植株,转化率为0.4%,且为单拷贝基因插入。本试验建立的优化条件为棕色棉的遗传转化奠定了理论基础。     

根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究

利用带有内含子gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导"鬼露甘"草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg/L,可明显抑制非转化组织的生长;300mg/L的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。     

农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究

研究了农杆菌介导玉米转基因过程中涉及的外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体等因素对愈伤组织生长及转化效率的影响。结果表明,同一基因型玉米自交系中有少数幼穗幼胚诱导出的愈伤组织生长速度快,转化效率高;高渗和农杆菌共培养以及除草剂筛选抑制愈伤组织的生长,致使部分转基因愈伤不能分化成苗,并提出其解决途径。