禽β-防御素的研究进展

已从鸡(Gallinacins)、火鸡(Gallopavin)和驼鸟(Ostricacin)的血液、鸡与火鸡的上皮细胞、以及企鹅(Sphenicins)的胃内容物中分离到多种禽β-防御素。综述了该类抗菌肽的分子特征、抗菌机理与应用前景。     

鸡β-防御素基因的克隆与结构分析

通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。     

重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析

鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。     

猪β-防御素体外抗菌活性和抗氧化活性研究

抗菌肽在哺乳动物先天免疫系统中发挥着非常关键的作用.猪β-防御素1(pBD-1)和β-防御素2(pBD-2)是猪体内两种重要的抗菌肽.本研究采用化学方法合成pBD-1和pBD-2,通过改良的微量肉汤稀释法研究了pBD-1和pBD-2对8种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌的抗菌活性,并利用透射电镜初步探究了pBD-1和pBD-2可能的杀菌机制;本研究还进一步探讨了pBD-1和pBD-2的体外抗氧化活性.抗菌试验结果表明,pBD-1对Escherichia coli EPEC O78:K80和Bacillus subtilis ATCC 6633具有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)均为32 μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)分别为32 μg/mL和128 μg/mL;pBD-2仅对Pseudomonas.aeruginosa CMCC 10104有较好的抗菌活性,MIC为8μg/mL,MBC为32μg/mL,对其他细菌抗菌活性较弱;透射电镜观察结果表明,pBD-1和pBD-2能够作用于菌体细胞膜杀灭细菌;抗氧化活性实验结果表明,pBD-1和pBD-2在0～256 μg/mL范围内,具有清除自由基的功能和还原力,且呈现浓度依赖效应.研究结果揭示,pBD-1和pBD-2对特定细菌发挥抗菌作用的同时,还具有一定的抗氧化活性,为进一步阐明pBD-1和pBD-2的生物学功能及其开发和应用提供了基础资料.     

胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布术

用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（Ga1-1）-Gallinacin-13（Ga1-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，GenBank登陆号为：DQ858311-DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Ga1-1（a）-Ga1-13，Ga1-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，均在96．5％-100％之间。利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果显示Ga1-1、Ga1-1（a）、Ga1-2、Ga1-3、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7、Ga1-8、Ga1-12和Ga1-13在同一大的分支上；Ga1-9和Ga1-10在同一分支；Ga1-11独在一分支上。用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因在不同组织中的分布，结果发现：Ga1-1、Ga1-2、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7和Ga1-10的表达分布非常广泛，Ga1-3、Ga1-8、Ga1-9、Ga1-11、Ga1-12和Ga1-13的分布少。     

胡须鸡β-防御素Gal-1-Gal-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1(Gal-1)～Gallinacin-13(Gal-13)共13个基因编码区全长片段.通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为:DQ858311～DQ858323.比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1(a)～Gal-13,Gal-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性.均在96.5%～100%之间.利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Gal-1、Gal-1(a)、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-12和Gal-13在同一大的分支上;Gal-9和Gal-10在同一分支;Gal-11独在一分支上.用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布少.     

家蝇防御素抗菌肽Des-hf突变体的抑菌活性

采用PCR定点突变技术,将家蝇(Musca domestica)防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf)第32位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1;采用同样的方法在des-hf基因的C端加上6个带有正电荷的赖氨酸(K),构成第2个突变体des-hf-MU2.采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对上述2个突变体进行表达.抗菌特性表明,抗菌肽突变体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较好的抑菌活性.琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4和8.0倍.酸稳定性试验显示,抗菌肽突变体在pH值为5～6时活性最高,热稳定性试验显示des-hf-MU1和des-hf-MU2 100℃加热10 min后仍具有抑菌活性.显示了两抗菌肽突变体具有良好的应用前景.     

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。     

家蝇防御素抗菌肽Des-hf突变体的抑菌活性研究

采用PCR定点诱变技术,将家蝇防御素抗菌肽成熟肽段的基因（des-hf gene）倒数第九个氨基酸由甘氨酸（G）突变为带正电荷的精氨酸（R）,构成第一个突变体des-hf-MU1。采用同样的方法在des-hf 基因的C端加上六个带有正电荷的赖氨酸（K）,构成第二个突变体des-hf-MU2。采用毕赤酵母表达系统对上述两个突变体进行表达,抗菌特性表明表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,根据琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4倍和8.0倍,且在PH值为5～6时活性最高,热稳定性实验显示des-hf-MU1、des-hf-MU2 100 ℃加热10min 后仍具有抑菌活性,这些充分显示了良好的应用前景。     

防御素（defensin）的研究进展

防御素是生物界较广泛存在的一类维生物和一些恶性细胞的短肽，它通常是２９～５４个氨基酸组成，通过至少６个保守半胱氨酸构成三对二硫键使肽合形成一个稳定的反向平行β片状结构，有的还含有一个α螺旋结构，防循素由于具有抗广谱微生物和恶性细胞的特性，因而将在医学和植物抗病工因工程上发挥重要作用本研究概述了国内外防御素研究的现状，并从结构和功能上对不同来源的防御素及部分杀菌肽进行了比较。     

抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽cecropinA(1-8)-melittin(1-18)基因片段,合成片段与酵母表达载体pPIC9K重组,构建胞外分泌表达载体pPIC9K-came,电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168宿主菌,对CAME抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,酵母表达抗菌肽具有抗菌活性且溶血活性显著降低;重组酵母在含2%葡萄糖pH7.0的YPD培养液中,250r/min震荡培养24h后,重组酵母菌的A600为6.0时,经0.5%甲醇在28℃条件下诱导48h能够诱导产生较高抗菌活性的抗菌肽。     

胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因克隆、序列分析与组织分布

用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术特异性地扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（简称Gal-1）～Gallinacin-13（简称Gal-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank中获得胡须鸡β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因的注册号为：DQ858311~ DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，其氨基酸的同源性均在96.5～100％之间。利用Clustalx软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-1（a）、3在同一分支上，Gal-4、5、8在同一分支上，Gal-2、12、13在同一分支上，Gal-6、7在同一分支，Gal-9、10在同一分支，Gal-11独在一分支上。同样用RT-PCR方法分析了胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现:Gal-1/2/4/5/6/7/10的表达分布非常广泛，Gal-3/8/9/11/12/13的分布少。     

牛胎儿成纤维细胞β-防御素(hBD3)基因转染及转基因克隆胚制备

用脂质体法将含有人β防御素3（hBD3）和绿色荧光蛋白（EGFP）基因的乳腺特异性表达载体pEBB导入牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选和PCR鉴定获得阳性细胞,将这些转hBD3基因的阳性细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞,进行PCR鉴定,获得转基因克隆胚,再将这些转基因克隆胚移入64头受体牛子宫,现有21头转基因克隆胚胎的受体牛妊娠3个月。本研究为获得转人β防御素3（hBD3）基因牛克隆胚、制作转基因克隆牛,及预防奶牛乳房炎的发生提供了可行的技术。     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列，按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列。经连接和PCR扩增，使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列（含凝血酶切割位点涟接成为嵌合DNA。将其插入到pET30a的T7启动子之下，构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBDs-Bra，在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后，得到了与预计分子量相同的蛋白，约占总蛋白的30．5％，产量约为1．4～2．8mg/mL。     

牛抗菌肽Bac7-Bac5-β串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及表达产物的研究

根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7、bac5和防御素（LAP）成熟肽基因序列,人工合成了抗菌肽融合基因Bac7-Bac5-β,克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中,构建了重组转座载体pFASTBac-B7-B5-β,转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-B7-B5-B,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞出现病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞,收集Sf9细胞超声破碎,12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的融合蛋白带,分子量大小为20kD,与预测大小相符,表达量约占细胞总蛋白的10.6％。体外抑菌实验表明重组的rB7-B5-B蛋白对大肠杆菌具有抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。     

人β防御素3和植物des-pGlu1-Brazzein融合蛋白的纯化、活性分析及其乳糖诱导表达条件优化

对乳糖诱导工程菌株BL-pET-hBD3-Bra表达的人β防御素3和植物des-pGlu1-Brazzein融合蛋白进行了纯化和活性分析。并对工程菌株的乳糖诱导表达条件进行了优化。对目的蛋白的活性分析表明,hBD3-Bra融合蛋白有一定的甜味,但是杀菌活性很弱,经凝血酶切割后,重组hBD3有明显的抑菌活性,des-pGlu1-Brazzein的甜度大约为蔗糖甜度的600倍。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示：高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用（P<0.01）,对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05);时间延长对于菌株生长有利（P<0.01）,对目的蛋白的表达无显著影响（P>0.05);温度对菌株生长和目的蛋白的表达均有显著影响（P<0.01）。进一步的研究表明,菌株在30℃-32℃生长,在30℃诱导最优,乳糖和IPTG的诱导结果无显著差异（P>0.05)。     

香芹酮/羟丙基-β-环糊精包合物的制备、表征及对硫色镰刀菌的抑制作用

为开发新型马铃薯抑菌保鲜材料，本研究通过共蒸发-冷冻干燥法制备出香芹酮/羟丙基-β-环糊精包合物，采用相溶解度法测定其稳定常数，并采用紫外光谱、¹H NMR光谱、热重分析、扫描电镜及X-射线衍射分析的方法进行表征，探究香芹酮/羟丙基-β-环糊精包合物对硫色镰刀菌的抑制效果。结果表明，香芹酮与羟丙基-β-环糊精成功生成了主客体比为1∶1的包合物，产率达到93.6%，表观稳定常数为409.39 L·mol^-1。生成包合物后，香芹酮的水溶性和热稳定性都明显增强，且对硫色镰刀菌具有明显的抑制作用，EC50值为3.11 mmol·L^-1。因此，将挥发性液体香芹酮制备成羟丙基-β-环糊精固体包合物可行，且对马铃薯贮藏病害干腐病病原菌硫色镰刀菌具有较强的抗菌活性。本研究结果为开发新型马铃薯抑菌保鲜材料提供了理论依据。     

断奶及日龄对仔猪骨髓组织抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响

抗菌肽PR-39（proline-arginine-rich39-amino acidpeptide）是cathelicidins家族中富含脯氨酸的小分子肽,最初从猪小肠上部分离得到,随后在猪的其它器官以及鼠的巨噬细胞、人的结肠腺癌细胞中均分离得到（Wu et al.,1999）。具有广谱抗菌活性,在动物机体免疫中发挥着重要的作用（Marone et al.,2000;Pierelli et al.,2000）。本实验用半定量RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）方法，以18S rRNA为内参，研究日龄及断奶对杜长大仔猪股骨骨髓组织抗菌肽PR-39mRNA相对表达量的影响，为如何促进猪体内抗菌肽的表达和探讨仔猪非特异性免疫的形成提供基本资料。     

鸵鸟异嗜白细胞抗菌肽的分离纯化及部分性质研究

目的：分离纯化出鸵鸟异嗜白细胞抗菌肽,并对其部分特性进行研究,为开发新一代高效肽类抗菌药提供依据。方法：使用氯化铵裂解、超声波破碎、醋酸提取、CM-Sepharose F F弱酸性阳离子交换层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）等方法,从鸵鸟异嗜白细胞中分离纯化出了抗菌肽,使用微量琼脂糖弥散法进行了抗菌活性与最小抑菌浓度（MIC）的测定,应用二级质谱（MS/MS）对抗菌肽的分子量进行测定。结果：在鸵鸟异嗜白细胞中存在抗菌肽,其对金黄色葡萄球菌S.aureus 1056MRSA、鸡大肠杆菌E.coli O78和白色念珠菌C.albicans ATCC10231具有较强的抑制作用;抗菌肽具有阳离子性质;热稳定性良好;经RP-HPLC纯化得到峰6、峰16和峰24,峰6对白色念珠菌的MIC为0.065μg/mL,峰16的分子量为4012.472Da,对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为3.971μg/mL和5.245μg/mL,峰24的分子量为3542.479Da,对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为26.472μg/mL和21.561μg/mL。结论：本研究得到的抗菌肽与已报道的鸵鸟抗菌肽ostricacins相比显示出更强的抑菌活性,是否为同一物质需要进一步的验证。