与黄瓜感花叶病毒病基因连锁的分子标记

本研究以黄瓜(Cucumis sativus L.)高感黄瓜花叶病毒(CMV)和高抗CMV亲本组合(HZL04-1×F-3)的F2分离群体为试材,采用极端个体分组法和AFLP技术筛选与黄瓜抗CMV基因连锁的分子标记.AFLP引物组合E22M88在抗病组和感病组间约200 bp处表现多态性.经F2单株分析,在感病亲本和感病单株中扩增出了约为200 bp的特异片段,而抗病亲本和抗病个体无此条带.该特异标记与CMV抗性基因相连锁,遗传距离为9.74 cM.测序结果显示,目标片段的大小为202 bp,并将该标记转换为了序列特征化扩增区域(SCAR)标记.提供了黄瓜材料CMV抗性鉴定的分子方法和手段,可用于分子标记辅助育种.     

检测葡萄抗黑痘病基因DNA探针的合成及应用

依据中国野生葡萄(Vitis pseudoreticulata)抗黑痘病(Sphaceloma ampelinum)基因RAPD标记OPS03-1354的全长序列,设计合成了两个寡聚核苷酸R1(5'-CAGAGGTCCCTAGCTAAT-3')和R2(5'-ACA ATCACCCAACTCCTC-3')作为引物.首先对获得该RAPD标记的种间杂交组合白河-35-1(V.pseudoret-iculata clone Baihe-35-1)×佳利酿(V.vinifera cv.Carignane)亲本及其F2 51株进行PCR分析,其中寡聚核苷酸R2能在抗黑痘病植株中扩增出约1100 bp的DNA片段.进一步用R2对另一种间杂交组合广西-1(V.pseudoreticulata clone Guangxi-1)×京可晶(V.vinifera cv.Jingkejing)F1 339株进行PCR检测,R2能在抗病植株中扩增出约1100 bp的DNA片段.最后用R2对48份葡萄资源包括中国野生葡萄、美国野生葡萄和欧洲葡萄进行了PCR检测,在抗病株系和品种中也能扩增出这一片段.结果表明,获得的约1100bp特异片段为葡萄抗黑痘病基因的序列特异性扩增区(SCAR)标记,凡扩增出该SCAR标记的植株即是抗黑痘病基因的携带者和抗黑痘病性状的表达者.将该SCAR标记克隆与测序,其实际长度为1110 bp,命名为SCS03-1110.获得该SCAR标记的18 bp寡聚核苷酸R2(5'-ACAATCACCCAACTCCTC-3')具有检测葡萄抗黑痘病基因的DNA探针作用.     

甘薯抗茎线虫病基因的AFLP标记的开发

以甘薯抗茎线虫病品种徐781和感茎线虫病品种徐薯18的杂交F1分离群体的186株单株为材料,利用分离群体分组分析法（BSA法）和AFLP技术,在抗感池中共筛选了800对AFLP引物,结果表明其中245对引物具有多态性。用这245对引物检测两亲本以及建池单株,发现引物组合E2M23和E33M20分别在抗病单株中扩增出1条在感病单株中未出现的特异条带,长度分别约为500 bp和200 bp,认为这2个AFLP标记与甘薯抗茎线虫病基因连锁,分别命名为E2M23500和E33M20200。根据这2个AFLP标记对F1代186个单株的扩增结果,经Mapmaker 3.0软件分析,发现这2个分子标记与抗茎线虫病基因位于同一连锁群并紧密连锁,它们与抗茎线虫病基因间的遗传距离分别为6.94 cM和11.1 cM。用这2个分子标记对10个中国甘薯主栽品种进行检测,所得结果与常规方法鉴定结果完全一致,表明2个分子标记可用于甘薯抗茎线虫病分子标记辅助育种。     

半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及其应用

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)性别控制与全雌育种相关研究需要一种快速、准确的性别特异分子标记。本研究通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星标记筛选,得到Z、W染色体同源片段相差35bp的位点,对其进行克隆和测序,针对所得测序结果,重新设计引物进行序列特异扩增区间(sequence characterized amplified region,SCAR)转化,增大35 bp差异片段在扩增片段中的所占比例;并摸索得到4%琼脂糖凝胶,150 V,25 min为最适电泳条件,所得SCAR标记可在雌性个体中扩增出169和134 bp两种DNA条带,雄性个体中扩增出169 bp DNA条带,超雌个体中扩增出134 bp DNA条带;将其应用于生产实践中,对半滑舌鳎生理雄性亲鱼576尾进行快速检测,在保证存活的前提下,剔除了亲鱼中的100尾伪雄鱼,有助于提高后代的雌性比例。本研究所得半滑舌鳎性别特异SCAR标记,可用于实验室对半滑舌鳎雌性、雄性和超雌个体遗传性别的准确测定和养殖场简易环境下养殖亲鱼雄鱼中伪雄个体的快速检测。     

黄瓜抗西瓜花叶病毒性状的序列特征性扩增区域(SCAR)标记

以抗西瓜花叶病毒 (Watermelon mosaic virus, WMV)的黄瓜（Cucumis sativus）品种秋棚和感该病毒的欧洲八号为亲本,构建了120个F6重组自交系群体。根据苗期抗病接种鉴定结果进行遗传分析,发现黄瓜抗WMV的基因是由隐性单基因控制。利用集团分离分析法和相关分子标记技术,获得的特异片段E-ACT/M-CTT-427与WMV的抗性基因连锁,连锁距离为8 cM。双亲差异片段测序结果显示感病亲本目标片段存在6个T碱基的缺失。根据测序结果设计了1对与目的基因遗传距离为8 cM的序列特征性扩增区域(SCAR)引物,该引物可用于黄瓜抗WMV病毒的分子标记辅助育种。     

甘薯抗茎线虫病基因AFLP标记的开发

以甘薯(Ipomoea batatas)抗茎线虫病品种徐781和感茎线虫病品种徐薯18杂交F1分离群体的186株单株为材料,利用分离群体分组分析法(BSA法)和AFLP技术,在抗感池中共筛选了800对AFLP引物,结果表明,其中245对引物具有多态性.用这245对引物检测两亲本以及建池单株,发现引物组合E2M23和E33M20分别在抗病单株中扩增出l条在感病单株中未出现的特异条带,长度分别约为500和200 bp,认为这2个AFLP标记与甘薯抗茎线虫病基因连锁,分别命名为E2M23500和E33M20200.根据这2个AFLP标记对F1代186个单株的扩增结果,经Mapmaker 3.0软件分析,发现这2个分子标记与抗茎线虫病基因位于同一连锁群并紧密连锁,它们与抗茎线虫病基因间的遗传距离分别为6.9和11.1 cM.用这2个分子标记对10个中国甘薯主栽品种进行检测,所得结果与常规方法鉴定结果完全一致,表明2个分子标记可用于甘薯抗茎线虫病分子标记辅助育种.     

SCAR标记技术鉴别榆黄蘑品种

为了建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定榆黄蘑菌株的有效方法,本研究通过对生产上常用的16个榆黄蘑菌株进行SRAP多态性分析,从榆黄蘑2号菌株中扩增获得了一个片段长为537bp的特异片段,将其克隆、测序并设计引物,成功转化为稳定的SCAR标记。试验结果表明,利用该特异SCAR标记,能在1d时间内准确鉴定出榆黄蘑2号菌株。由此可见,SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定榆黄蘑菌株的新方法。     

甘蔗祖亲种RAPD标记的序列特征性片段扩增区域（SCAR）转化分析

采用RAPD标记技术获得了甘蔗(Saccharum)亲本种RSp2、RSp5、RSp6、RSo13和RSp16 5个RAPD标记特异片段.根据这5个特异片段的测序结果,设计了15对特征性片段扩增区域(SCAR)标记引物,并经SCAR标记特异引物筛选,ZT51、ZT52、ZT53、ZT55及ZT56为割手密种特异引物.RSp2这一甘蔗割手密种特异的RAPD标记被成功转化为割手密种(S.spontaneum)特异SCAR标记,记为ZT51-439.在甘蔗种质检测时,能在崖城割手密、印度割手密及部分云南割手密亲本种中特异检测出,并在具有割手密血缘的47份栽培种中均能检测到明显而唯一的439 bp割手密种特异条带.     

用限制性酶切和Southern杂交对葡萄无核基因分子标记的分析

对葡萄（Vitis vinifera）无核基冈特异标记39970524-5-564和39970524—6—1538的DNA序列进行了克隆和测序，其序列全长分别为564和1538bp，GenBank登录号为AY327513和AY327514。用Wingene231 DNA分析软件对39970524—5—564和39970524—6—1538序列的限制性内切酶酶切位点进行了分析，可识别6个碱基及其以上序列的酶切位点分别有30和131个；EcoRⅠ和HindⅢ在39970524—5—564特异标记上没有酶切位点，而EcoRⅠ在39970524—6—1538第135个碱基处有一个酶切位点，HindⅢ在39970524—6—1538上没有酶切位点。用39970524—5—564DNA作探针对葡萄基因组DNA作Southern杂交，结果在无核亲本红光无核及无核基阏供给者无核白和无核杂种上出现杂交带，而且呈单拷贝，而在有核亲本红地球及有核杂种上未出现杂交带，进一步证明了39970524—5—564特异片段来源于无核葡萄基因组，为检测和克隆葡萄无核基因提供了证据。     

我国“应县小黑豆”对SCN4号生理小种抗性的SSR及ISSR分子标记研究

本研究以"应县小黑豆"×"晋豆23"杂交组合F2群体为材料,用塑膜钵柱法进行抗性鉴定,利用分离体分组分析法(BSA)结合SSR和ISSR标记技术对抗性基因进行分子标记筛选和定位,旨在实现大豆孢囊线虫抗性育种中亲本和杂交后代的分子标记辅助选择.筛选到2个与抗SCN基因座位连锁的分子标记Satt038和ISSR811.Satt038片段含180bp和185 bp,为共显性标记,在F2群体中的分离比为121;ISSR标记ISSR811为显性标记,片段长350bp,F2群体分离比为13.2个标记在F2群体中呈孟德尔式遗传.通过JOINMAP分析,微卫星标记Satt038、ISSR标记ISSR811与抗SCN基因座位的遗传距离分别为26.9cM和10.2 cM.还探讨了分子标记Satt038和ISSR811用于大豆抗SCN育种进行分子标记辅助选择的可能性.     

花青素调节基因VlmybA2对番茄遗传转化

以小型番茄Micro-Tom为材料,利用农杆菌介导法导入花青素调节基因VlmybA2.对抗性筛选出的再生植株进行GUS组织染色和PCR检测,证明外源基因已经整合到Micro-Tom中,转基因番茄根、茎、叶脉、果皮均呈紫色,花色为黄紫嵌合.而野生型的根为白色,茎、叶脉呈绿色,果皮为红色,花为黄色.对转基因番茄的花青素含量、叶片叶绿素含量和光合速率等生理指标进行测定,花青素含量有显著增加,叶绿素含量降低,VlmybA2基因过量表达会降低植株的光合效率,但对植株正常生长影响并不显著.VlmybA2基因既可增加抗衰老物质花青素含量,又可作为转基因植株的报告基因.     

VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)严重威胁茄科蔬菜作物的生产。抗性标记Ty-1和Ty-3是一对等位基因,在番茄抗TYLCV育种中应用较为广泛。为了探究Ty-1/Ty-3抗病毒分子机制,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性标记的番茄Y19为材料,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术,沉默RNA干扰(RNAi)机制关键基因,即番茄核糖核酸内切酶编码基因2a/b/c/d(SlDCL2)和番茄核糖核酸内切酶编码基因4(SlDCL4),初步分析其在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能。PCR与测序结果发现SlDCL2、SlDCL4的VIGS沉默载体pTRV2∶SlDCL2和pTRV2∶SlDCL4构建成功。以沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)基因为标记植株,定量PCR检测SlDCL2、SlDCL4沉默株系中SlDCL2、SlDCL4基因的沉默效率,结果显示SlDCL2、SlDCL4沉默株系中对应基因的表达均小于对照植株的50%,表明SlDCL2、SlDCL4沉默载体确实可以降低对应基因的表达,且不影响其他DCL基因的表达。VIGS沉默植株SlDCL2、SlDCL4基因后接种TYLCV,接种TYLCV 30dpi结果显示,Y9材料表现出明显的TYLCV病毒症状,通过比较植株发病严重度发现,SlDCL2、SlDCL4沉默株系发病严重度分别为1.97、2.35,显著高于空载体注射株系(0.14)和对照株系(0.07)。本研究结果表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中发挥着重要作用,这为利用Ty-1/3抗性标记基因育种奠定了基础。     

番茄抗黄化曲叶病毒育种研究进展

本文分别对近年番茄抗黄化曲叶病毒的传统育种、分子辅助育种、基因工程育种进展进行了综述。栽培番茄均不抗番茄黄化曲叶病毒,所以传统育种采用从野生近缘种中筛选抗性材料,以其为亲本与栽培番茄进行杂交来获得抗性;野生近缘种中的抗性位点Ty-1、Ty-2和Ty-3及一些QTLs先后被定位,也筛选出了可鉴定巩一,基因的SSR-47标记及鉴定Ty-3的SCAR标记;通过转基因技术获得抗性是研究热点之一,目前转入番茄后表现出抗性的序列有TYLCV病毒的CP基因、REP基因的部分序列或反义序列、不编码的保守序列以及源于白粉虱的GroEL基因。同时讨论了今后的主要发展方向。     

BTH诱导番茄耐番茄斑萎病毒(TSWV)研究

番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Orthotospovirus,TSWV)是番茄生长过程中发生严重的病毒病之一,严重威胁世界各地番茄的安全生产。为了研究植物诱导抗性在番茄抗TSWV中的防御作用,本研究以矮番茄为研究对象,使用苯并噻二唑(BTH)前处理番茄植株,研究BTH诱导的TSWV抗性,并分析BTH处理番茄植株后的发病严重度、病毒含量、植株抗氧化能力、质膜稳定性、细胞的解离情况,以及SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达量。结果表明,0.1 mmol·L^-1BTH前处理番茄植株能够诱导丝裂原活化蛋白激酶级联信号通路关键基因SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达,提高细胞抗氧化酶活性及质膜稳定性,并减轻病毒对细胞的破坏,从而增强番茄植株对TSWV耐性,抑制TSWV在番茄植株中的复制,BTH前处理植株发病的严重度显著低于对照。本研究为诱导植物抗病毒研究奠定理论基础。     

番茄果实中LeERFl、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对番茄(Lycopersicon esculenturm)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较,在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物,通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段,用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期),得到两个基因LeERFl和LeERF2.通过BLAST工具在GenBank中搜索表明,LeERFl和LeERF2基因属于EREBP家族,LeERFl与EREBP-4和DDTFRl0/A在氨基酸水平上的序列相似性为35%,LeERF2与EREBP-3和pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因.LeERFl和LeERF2的核酸序列在GenBank发表,登录号分别为AY077626和AY275554.     

转基因（反义ACS和反义Nr）番茄伤流中植物激素的运输＊

以转反义ACS（ACC合成酶）和反义NR（乙烯受体蛋白）基因番茄和普通番茄（Lycopersicon escclentum Mill．）作为试材，通过ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）方法研究了抑制乙烯合成的外源基因转入番茄后，伤流中植物激素的变化。发现转基因番茄和普通番茄在盛花期和盛果期伤流中各种植物激素的含量变化不显著；而到了成熟期伤流中IAA、GA，和CTKs（细胞分裂素）仍然没有显著变化，但转基因番茄伤流中ABA含量与普通番茄相比却显著减少，说明ABA和乙烯对番茄成熟衰老的控制是共同起作用的，乙烯释放量的改变和信号转导途径的抑制都会影响ABA的伤流运输。     

中国台湾番茄曲叶病毒侵染引起广东番茄黄化曲叶病

广东汕头番茄(Lycopersicon eseulentum)上发生的黄化曲叶病毒病,田间症状表现为病株明显矮化、病叶褪绿黄化、叶小且卷曲和叶质较脆硬。对该病毒代表分离物(BS)基因组DNA-A克隆和测定结果表明,其全长为2740nt(GenBank acces-sion No.DQ237918),具有菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,有6个ORFs,分别位于病毒链上的AV1、AV2及位于互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4;在基因AV2与AC1之间有269nt的非编码区。BLAST结果显示,BSDNA-A与Begomovirus中来自亚洲的病毒同源性较高,而与美洲、非洲等地的相对较低;其中与中国台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)DNA-A全序列同源性最高,为97.7%,而二者的AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4基因及IR的同源性分别为98.6%、98.0%、98.0%、97.5%、96.3%、98.6%和96.6%,推导编码的6个蛋白的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、97.5%、95.6%、91.8%和99.0%%。全序列系统进化关系树显示,BS与ToLCTWV的亲缘关系最近,并形成一个独立分支,再与广东番茄曲叶病毒G2(Tomato leaf curl Guangdong virus G2,ToLCGDV-[G2]和广东番茄曲叶病毒G3(Tomato leaf curl Guangdong virus G3,ToLCGDV-[G3]形成一个大的分支,而与其它33种Begomovirus病毒的亲缘关系均相对较远。这些结果表明,BS应是ToLCTWV的一个分离物。     

BTH诱导番茄耐番茄斑萎病毒(TSWV)研究

番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Orthotospovirus,TSWV)是番茄生长过程中发生严重的病毒病之一,严重威胁世界各地番茄的安全生产。为了研究植物诱导抗性在番茄抗TSWV中的防御作用,本研究以矮番茄为研究对象,使用苯并噻二唑(BTH)前处理番茄植株,研究BTH诱导的TSWV抗性,并分析BTH处理番茄植株后的发病严重度、病毒含量、植株抗氧化能力、质膜稳定性、细胞的解离情况,以及SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达量。结果表明,0.1 mmol·L^-1BTH前处理番茄植株能够诱导丝裂原活化蛋白激酶级联信号通路关键基因SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达,提高细胞抗氧化酶活性及质膜稳定性,并减轻病毒对细胞的破坏,从而增强番茄植株对TSWV耐性,抑制TSWV在番茄植株中的复制,BTH前处理植株发病的严重度显著低于对照。本研究为诱导植物抗病毒研究奠定理论基础。     

应用15N标记尿素研究硝化抑制剂对设施番茄氮素去向的影响

为明确硝化抑制剂2-氯-6-三氯甲基吡啶(简称CP)在设施蔬菜上的应用效果及其增效机制,本研究采用田间微区试验,应用¹⁵N稳定性同位素示踪技术研究了在推荐施氮量(180 kg·hm^-2)和习惯施氮量(300 kg·hm^-2)下,CP对设施番茄氮素去向的影响,并进行了其增效机制的初探。结果表明,在施氮量为180和300 kg·hm^-2条件下,施用CP可增加番茄产量17.3%和31.4%,肥料氮回收率分别增加8.6和9.2个百分点,氨挥发排放增加了2.47和3.65 kg·hm^-2,其他损失合计减少了15.5和27.6 kg·hm^-2。 添加CP促进了氮素从茎和叶向果实的转移,且减少了氮素损失,提高了氮素利用率,这可能是其增效的机制之一。施用CP带来的经济效益显著高于其成本,在蔬菜生产上值得应用与推广。