检测葡萄抗黑痘病基因DNA探针的合成及应用

依据中国野生葡萄(Vitis pseudoreticulata)抗黑痘病(Sphaceloma ampelinum)基因RAPD标记OPS03-1354的全长序列,设计合成了两个寡聚核苷酸R1(5'-CAGAGGTCCCTAGCTAAT-3')和R2(5'-ACA ATCACCCAACTCCTC-3')作为引物.首先对获得该RAPD标记的种间杂交组合白河-35-1(V.pseudoret-iculata clone Baihe-35-1)×佳利酿(V.vinifera cv.Carignane)亲本及其F2 51株进行PCR分析,其中寡聚核苷酸R2能在抗黑痘病植株中扩增出约1100 bp的DNA片段.进一步用R2对另一种间杂交组合广西-1(V.pseudoreticulata clone Guangxi-1)×京可晶(V.vinifera cv.Jingkejing)F1 339株进行PCR检测,R2能在抗病植株中扩增出约1100 bp的DNA片段.最后用R2对48份葡萄资源包括中国野生葡萄、美国野生葡萄和欧洲葡萄进行了PCR检测,在抗病株系和品种中也能扩增出这一片段.结果表明,获得的约1100bp特异片段为葡萄抗黑痘病基因的序列特异性扩增区(SCAR)标记,凡扩增出该SCAR标记的植株即是抗黑痘病基因的携带者和抗黑痘病性状的表达者.将该SCAR标记克隆与测序,其实际长度为1110 bp,命名为SCS03-1110.获得该SCAR标记的18 bp寡聚核苷酸R2(5'-ACAATCACCCAACTCCTC-3')具有检测葡萄抗黑痘病基因的DNA探针作用.     

烟粉虱B型及二个非B型种群的SCAR分子标记

用随机引物H16对浙江采集的烟粉虱(Bemisia tabaci)B型和2个非B型种群进行RAPD分子标记，结果表明: B型、非B型ZHJ-1和非B型ZHJ-2 3个种群分别能稳定地扩增出446、390和1317 bp的特异性片段。将3个种群的特异性片段分别克隆和测序，根据测序结果设计3对SCAR引物。通过PCR反应条件的优化，B型、非B 型ZHJ-1和非B型ZHJ-2 3个种群各自的SCAR引物分别能扩增出本种群的特异性条带，其大小依次为439、366和1238 bp，而其它种群与温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum )则无扩增。     

与黄瓜感花叶病毒病基因连锁的分子标记

本研究以黄瓜(Cucumis sativus L.)高感黄瓜花叶病毒(CMV)和高抗CMV亲本组合(HZL04-1×F-3)的F2分离群体为试材,采用极端个体分组法和AFLP技术筛选与黄瓜抗CMV基因连锁的分子标记.AFLP引物组合E22M88在抗病组和感病组间约200 bp处表现多态性.经F2单株分析,在感病亲本和感病单株中扩增出了约为200 bp的特异片段,而抗病亲本和抗病个体无此条带.该特异标记与CMV抗性基因相连锁,遗传距离为9.74 cM.测序结果显示,目标片段的大小为202 bp,并将该标记转换为了序列特征化扩增区域(SCAR)标记.提供了黄瓜材料CMV抗性鉴定的分子方法和手段,可用于分子标记辅助育种.     

SCAR标记技术鉴别榆黄蘑品种

为了建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定榆黄蘑菌株的有效方法,本研究通过对生产上常用的16个榆黄蘑菌株进行SRAP多态性分析,从榆黄蘑2号菌株中扩增获得了一个片段长为537bp的特异片段,将其克隆、测序并设计引物,成功转化为稳定的SCAR标记。试验结果表明,利用该特异SCAR标记,能在1d时间内准确鉴定出榆黄蘑2号菌株。由此可见,SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定榆黄蘑菌株的新方法。     

斑茅杂种后代分子检测

利用RAPD随机引物和斑茅5S rRNA间隔序列(ITS)引物对斑茅与甘蔗的杂种F1、F2代进行了分子鉴定，获得了与含有斑茅血缘有关的RAPD分子标记3个及5S rRNA间隔序列标记1个；其中，5SrRNA间隔序列标记可用于斑茅杂种后代碱法DNA模板的快速检测。     

半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及其应用

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)性别控制与全雌育种相关研究需要一种快速、准确的性别特异分子标记。本研究通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星标记筛选,得到Z、W染色体同源片段相差35bp的位点,对其进行克隆和测序,针对所得测序结果,重新设计引物进行序列特异扩增区间(sequence characterized amplified region,SCAR)转化,增大35 bp差异片段在扩增片段中的所占比例;并摸索得到4%琼脂糖凝胶,150 V,25 min为最适电泳条件,所得SCAR标记可在雌性个体中扩增出169和134 bp两种DNA条带,雄性个体中扩增出169 bp DNA条带,超雌个体中扩增出134 bp DNA条带;将其应用于生产实践中,对半滑舌鳎生理雄性亲鱼576尾进行快速检测,在保证存活的前提下,剔除了亲鱼中的100尾伪雄鱼,有助于提高后代的雌性比例。本研究所得半滑舌鳎性别特异SCAR标记,可用于实验室对半滑舌鳎雌性、雄性和超雌个体遗传性别的准确测定和养殖场简易环境下养殖亲鱼雄鱼中伪雄个体的快速检测。     

与南瓜矮生基因连锁的分子标记

以中国南瓜(Cucurbita moschata Duch)矮生突变体(矮10)为供体亲本,以印度蔓生南瓜(C.maxima Duch)(蒙日南瓜)为轮回亲本,经6代回交和2代自交选育出S1~S9共9个南瓜矮生近等基因纯合株系,其中S2株系再与蒙日南瓜杂交获得F2分离群体共306株。利用RAPD技术,采用近等基因系(near isogenic lines,NILs)分析法,结果表明,在640条随机引物中,发现RAPD标记S1225-548与矮生单基因D呈现连锁关系,遗传距离为2.29cM。RAPD标记成功转化成更为稳定的SCAR标记SCAR3-398。     

粘类小麦雄性不育系线粒体DNA的AFLP标记及SCAR转化

为了能在分子水平上有效鉴定具有粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、偏凸山羊草(A.ventricosa)、普通小麦变种斯卑尔脱(Triticum spelta)细胞质雄性不育系及其保持系90-110和8222,提高其在杂交小麦(Triticum aestivum L.)研究与应用中的定向遗传改良,本研究对其线粒体DNA进行了扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记和序列特征性片段扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)标记。通过AFLP标记方法,应用64对引物组合EcoRⅠ-NNN/MseⅠ-NNN对小麦同核异质雄性不育系和保持系进行扩增,共扩增出682条带,其中113条为多态性条带。引物E-AGG/M-CTA组合在粘果山羊草细胞质雄性不育系中扩增出一条大小约300 bp的特异性条带,对该特异条带进行回收、测序,利用Primer Premier 5.0软件重新设计SCAR引物,并对这3种类型同核异质小麦细胞质雄性不育系和保持系进行扩增,其中引物YW1在3种细胞质雄性不育系和保持系中都扩增出条带,而引物YW2仅在粘果山羊草细胞质雄性不育系扩增出一条198 bp的特异性片段,结果表明,已成功地将AFLP标记转化为操作简便、表现稳定的SCAR标记。此片段与小麦线粒体基因组有很高的同源性(同源性为99%),为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶基因(GenBank登录号:EU534409.1)上的序列,该酶是线粒体中氧化磷酸化的入口酶,与小麦细胞质雄性不育密切相关。本研究可以用于粘类小麦细胞质雄性不育系分子标记辅助育种,也为小麦细胞质种性鉴定提供了技术支撑和理论依据。     

甘薯抗茎线虫病基因AFLP标记的开发

以甘薯(Ipomoea batatas)抗茎线虫病品种徐781和感茎线虫病品种徐薯18杂交F1分离群体的186株单株为材料,利用分离群体分组分析法(BSA法)和AFLP技术,在抗感池中共筛选了800对AFLP引物,结果表明,其中245对引物具有多态性.用这245对引物检测两亲本以及建池单株,发现引物组合E2M23和E33M20分别在抗病单株中扩增出l条在感病单株中未出现的特异条带,长度分别约为500和200 bp,认为这2个AFLP标记与甘薯抗茎线虫病基因连锁,分别命名为E2M23500和E33M20200.根据这2个AFLP标记对F1代186个单株的扩增结果,经Mapmaker 3.0软件分析,发现这2个分子标记与抗茎线虫病基因位于同一连锁群并紧密连锁,它们与抗茎线虫病基因间的遗传距离分别为6.9和11.1 cM.用这2个分子标记对10个中国甘薯主栽品种进行检测,所得结果与常规方法鉴定结果完全一致,表明2个分子标记可用于甘薯抗茎线虫病分子标记辅助育种.     

阿维菌素抗性小菜蛾的RAPD和SCAR标记

Black et al．（1992）利用RAPD（random amplified polymorphic DNA）技术对四种蚜虫进行了鉴别比较；Kambhampiti et al．（1992）将RAPD技术用于鉴定和区别蚊子的种和种群：Heckel et al．（1995）对小菜蛾抗Bt品系和敏感品系的基因组DNA进行了RAPD标记研究，获得了118条抗性品系特有的扩增带。目前有关应用RAPD对阿维菌素抗性小菜蛾进行标记研究未见文献报道。本研究拟采用RAPD技术寻找阿维菌素抗性小菜蛾特异性片段，并将其转化为更稳定的SCAR（Sequence-charactcrized amplified region）检测标记，旨在为建立实用的阿维菌素抗性小菜蛾分子检测技术提供基本资料。