小尾寒羊高繁殖力候选基因INHA的研究

采用PCR-SSCP技术检测抑制素α(inhibin α,INHA)基因5'调控区和外显子1在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)以及低繁殖力绵羊品种(中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。小尾寒羊、中国美利奴绵羊和考力代绵羊在INHA基因5'调控区发生了1处碱基突变(316C→T),南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变;突变纯合型(BB)和突变杂合型(AB)小尾寒羊平均产羔数分别比野生型(AA)多1.45只(P<0.01)和0.90只(P<0.01)。小尾寒羊和考力代绵羊在INHA基因外显子1中发生了1处碱基突变(877T→C),中国美利奴绵羊和南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变;突变纯合型(DD)和突变杂合型(CD)小尾寒羊平均产羔数分别比野生型(CC)多1.32只(P<0.01)和0.77只(P<0.01)。研究结果初步表明INHA基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记。     

小尾寒羊和湖羊高繁殖力候选基因BMPR-IB的研究

以控制Booroola Merino绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊、湖羊)以及低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、萨福克羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响.结果表明高繁殖力的小尾寒羊和湖羊在BMPR-IB基因编码序列第746位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的突变(A746G),而低繁殖力的多赛特和萨福克绵羊则没有发生这种突变.小尾寒羊B等位基因频率为0.716,+等位基因频率为0.284;湖羊B等位基因频率为0.941,+等位基因频率为0.059.高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊、湖羊)与低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、萨福克羊)之间BMPR-IB基因型分布差异极显著(P＜0.001).BB基因型小尾寒羊第一胎和第二胎产羔数分别比++基因型多产0.92只(P＜0.01)和1.02只(P＜0.01).BMPR-IB基因型在几个绵羊品种之间的分布以及各种基因型绵羊的实际产羔两方面的研究结果都证明BMPR-IB基因是影响小尾寒羊和湖羊高繁殖力的一个主效基因,可以用于对绵羊产羔数的辅助选择.     

小尾寒羊微卫星座位LSCV043与FecB基因的连锁分析

分析与FecB(Fec=fecundity,B=Booroola)基因紧密连锁的微卫星座位LSCV043在高繁殖力绵羊(OviS aries)品种(小尾寒羊)和低繁殖力绵羊品种(特克塞尔和多赛特)中的遗传多态性,同时分析了该微卫星座位与小尾寒羊FecB基因的连锁不平衡关系.高繁殖力的小尾寒羊在骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因编码序列第746位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的FecB突变(A746G),而低繁殖力的特克塞尔和多赛特绵羊则没有发生这种突变;小尾寒羊BB、B+和++基因型频率分别为0.487、0.398和0.115.微卫星座位LSCV043在3个绵羊品种365个个体中共检测到6个等位基因和13种基因型,最小等位基因为98 bp.最大等位基因为132bp;小尾寒羊(n=269)、特克塞尔(n=48)、多赛特(n=48)和BB基因型(n=131)、B+基因型(n=107)、++基因型(n=31)小尾寒羊中频率最大的等位基因分别是132、112、110、110、132和110 bp或112 bp,多态信息含量分别是0.750、0.769、0.757、0.712、0.762和0.774.连锁不平衡分析显示,小尾寒羊FecB基因B等位基因与LSCV043微卫星座位98 bp等位基因之间存在一定的连锁不平衡(D'=0.464),+等位基因与LSCV043微卫星座位104bp等位基因存在较强的连锁不平衡(D'=0.636).研究结果初步表明,LSCV043微卫星座位98bp等位基因与小尾寒羊FecB基因B等位基因之间存在一定的连锁不平衡关系,是与小尾寒羊多羔主效基因紧密连锁的一个遗传标记.     

绵羊抑制素βA基因多态性及其与产羔数关系的研究

设计7对引物,采用PCR-SSCP技术检测抑制素βA亚基(inhibin βA,INHBA)基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、特克塞尔羊和德国肉用美利奴羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊产羔数的影响。结果发现引物1-2、2-2和2-4扩增片段有多态性,其余4对引物的扩增片段均不存在多态性。引物1-2,多赛特羊只出现BB基因型,而其余4个绵羊品种则出现AA、AB和BB基因型;测序结果表明,BB型和AA型相比在INHBA基因5'端调控区第50位碱基处发生1处突变(G→A),该突变没有导致氨基酸的改变;小尾寒羊AA、AB和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异都不显著(P>0.05)。引物2-2,多赛特羊和德国肉用美利奴羊出现GG、GH和HH基因型,而其余3个绵羊品种只出现GG基因型;测序结果表明HH型和GG型相比在INHBA基因外显子2第142位碱基处发生1处突变(C→T),该突变导致了氨基酸由丝氨酸改变为亮氨酸。引物2-4,德国肉用美利奴羊只出现KK和KL基因型,而其余4个绵羊品种则出现KK、KL和LL基因型;测序结果表明LL型和KK型相比在INHBA基因外显子2第95位碱基处发生1处突变(G→A),该突变没有导致氨基酸的改变;小尾寒羊KK、KL和LL基因型之间产羔数的最小二乘均值差异均不显著(P>0.05)。研究结果初步表明,检测的INHBA基因位点对小尾寒羊高繁殖力没有显著影响。     

小尾寒羊BMP4基因多态性及其与高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）基因外显子2、3和4在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊）和低繁殖力绵羊品种（中国美利奴绵羊、考力代绵羊、南非肉用美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：外显子2和4在4个绵羊品种中都不存在多态性,外显子3则都存在多态性。对于外显子3的引物,在4个绵羊品种中都检测到3种基因型(AA、AB、BB);统计结果表明：小尾寒羊、中国美利奴绵羊、考力代绵羊、南非肉用美利奴绵羊AA基因型频率分别为0.017、0.216、0.115、0.429,AB基因型频率分别为0.102、0.317、0.269、0.500,BB基因型频率分别为0.881、0.467、0.616、0.071;测序结果表明：BB型和AA型相比在BMP4基因外显子3第305位碱基处发生C→A的突变,该突变导致氨基酸由丙氨酸改变为天冬氨酸;BB型小尾寒羊平均产羔数分别比AB型和AA型多0.61只（P<0.05）和1.01只（P<0.05）。     

催乳素基因多态性及其与小尾寒羊高繁殖力关系的研究

设计5对引物，采用PCR-SSCP技术检测催乳素（prolactin，PRL）基因外显子1至外显子5在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（多赛特、特克塞尔和考力代）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。通过克隆测序首次获得了绵羊PRL基因外显子全序列。结果表明：外显子2在5个绵羊品种中均存在单核苷酸多态性，而其它4个外显子只在湖羊中存在单核苷酸多态性。本研究初步表明小尾寒羊PRL基因外显子2的CC型平均产羔数分别比CD型和DD型多0.39只（P<0.05）和0.98只（P<0.05），CD型和DD型小尾寒羊平均产羔数差异不显著（P>0.05）。     

GnRHR基因多态性及其与小尾寒羊高繁殖力关系的研究

设计8对引物,应用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测促性腺激素释放激素受体（gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR）基因外显子1、外显子2和外显子3在高繁殖力品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力品种（南非肉用美利奴、考力代和中国美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果发现引物P4和P7扩增片段具有多态性,其余6对引物的扩增片段都不存在多态性。对于P4扩增片段,在湖羊中检测到AA和BB基因型,在其余4个绵羊品种中只检测到AA基因型,BB型与AA型相比在外显子1有5个突变（+692G→A、+706T→A、+747T→C、+748A→T和+802T→A）,并引起氨基酸改变（Gly→Ser、Asp→Glu和Leu→Pro）。对于P7扩增片段,在小尾寒羊和湖羊中都检测到CC和DD基因型,在低繁殖力的3个绵羊品种中均只检测到CC基因型,DD型与CC型相比在外显子2有+50A→G和+101A→C两个突变,并引起氨基酸改变（Glu→Gly和Gln→Pro）;小尾寒羊CC和DD基因型频率分别为0.87和0.13,突变纯合型（DD）小尾寒羊平均产羔数比野生型（CC）多0.81只（P<0.01）。     

绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性分析

促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)在光周期介导的哺乳动物季节性繁殖过程中起着非常重要的作用,但在绵羊(Ovis aries)中的遗传特性与分子机制仍不明晰.本研究以筛选的绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点SNP为候选分子标记,利用多聚酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction-single strand conformation polymerase,PCR-SSCP)技术,检测该位点在繁殖特性不同的阿勒泰羊、中国美利奴羊、萨福克羊、多浪羊以及湖羊和小尾寒羊群体中的多态性.结果表明,绵羊TSHR基因在第10外显子481 bp处发生了T-C突变,为同义突变,SSCP检测出3种基因型:TT、TC和CC,T481C位点的TT基因型在常年发情的湖羊、小尾寒羊和多浪羊群体中属于优势基因型,而在季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊群体中比率最低,仅为8％;方差分析结果表明,常年发情的多浪羊、小尾寒羊和湖羊群体T481C位点的基因型频率与季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊存在极显著差异(P＜0.01).研究结果提示,绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性在常年发情与季节性繁殖绵羊群体中分布存在较大差异,该SNP可作为一个理想的分子标记应用于常年发情绵羊品种选育.     

绵羊骨形态发生蛋白受体IB基因部分3′非翻译区的多态性分析

根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB（bone morphogenetic protein receptor IB, BMPR-IB）基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3′非翻译区序列在4个绵羊品种（小尾寒羊、湖羊、特克塞尔和中国美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性。结果发现引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性。对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型。测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变（121T→C和195T→C）。     

绵羊骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因部分3'非翻译区的多态性分析

根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3'非翻译区序列在绵羊(Ovis aries)高繁殖力品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力品种(特克塞尔和中国美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊和湖羊高繁殖力的影响.结果发现,引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性.对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型;测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变(121T→C和195T→C);湖羊AA和BB基因型频率分别为0.575和0.425,湖羊AA和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异不显著(P>0.05).研究结果初步表明,检测的BMPR-IB基因位点对小尾寒羊和湖羊高繁殖力都没有显著影响.     

小尾寒羊BMP15基因多态性及其与高繁殖力关系的研究

以控制Belclare、Cambridge、Hanna、Inverdale和Lacaune绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15基因(bonemorpho-geneticprotein15,BMP15)为候选基因,根据绵羊BMP15基因全序列设计6对引物覆盖全部的外显子,采用PCR-SSCP方法检测BMP15基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特羊)中的多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,只有外显子1的第1对引物扩增片段具有多态性,其余5对引物扩增片段都没有多态性。在127只小尾寒羊母羊和30只多赛特母羊中都检测到两种基因型(AA和AB)。统计结果表明,小尾寒羊和多赛特羊AA基因型频率分别为0.638和0.800,AB基因型频率分别为0.362和0.200。测序结果表明,AB基因型和AA基因型相比在cDNA第28bp处缺失了3个碱基(CTT),小尾寒羊和多赛特绵羊都发生了与Belclare、Cambridge、Hanna和Inverdale绵羊相同的CTT缺失突变。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0.20只,但差异不显著(P>0.05)。研究结果提示,BMP15基因的CTT缺失突变对小尾寒羊高繁殖力没有显著影响。     

小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的绵羊品种小尾寒羊和季节性发情的绵羊品种多赛特羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A，MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明, 小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的绵羊序列(GenBank登录号U14109)完全相同。小尾寒羊与多赛特羊MTNR1A基因外显子2的差异由5个变化的核苷酸(分别为C329T、G355T、C566T、C580A和A675G)组成，核苷酸同源性为99.4%。小尾寒羊与山羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠和鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.2%～98.5%，氨基酸序列同源性为78.5%～98.5%。     

绵羊GlyCAM-1基因克隆、核苷酸变异及其组织表达分析

糖基化依赖细胞粘附分子(GlyCAM-1)是粘液素(mucin)糖蛋白家族的成员,是乳腺细胞合成的一种乳脂球膜蛋白(MFGMPs)的重要组成部分。GlyCAM-1在乳腺发育和泌乳中发挥着重要作用,为探究该基因的序列特征、核苷酸序列变异和表达特征,以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)和低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)的乳腺组织为研究对象,利用克隆测序、RT-qPCR、生物信息学等方法克隆绵羊GlyCAM-1基因的编码区,分析GlyCAM-1的理化性质和蛋白质结构,并检测GlyCAM-1基因的组织表达特性。结果表明,绵羊的GlyCAM-1基因CDS区全长465 bp,编码154个氨基酸。测序结果表明,在该基因CDS区检测到7个SNPs,其中2个为同义突变,5个为错义突变。GlyCAM-1二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,延伸链则散布于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,GlyCAM-1蛋白与CD34、MadCAM-1都作为L-选择素(L-selectin)的配体发挥作用;RT-qPCR结果表明,GlyCAM-1基因表达具有组织特异性、品种特异性和时空特异性,乳腺、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢和背最长肌8个组织中,GlyCAM-1基因只在乳腺和肺脏组织中表达,在其余6个组织中均不表达,其中乳腺中的表达量最高;在泌乳高峰期的乳腺组织中,GlyCAM-1在高泌乳量的小尾寒羊中的表达量显著高于甘肃高山细毛羊(P<0.05);在小尾寒羊的乳腺组织中,GlyCAM-1在泌乳高峰期的表达量极显著高于空怀期(P<0.01)。本研究结果丰富了绵羊基因组数据,为深入研究GlyCAM-1基因的泌乳生物学功能及其机理提供了基础数据。