甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)新品系农大603是从感茎线虫(Ditylenchus destructor)病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。以农大603和徐薯18块根的mRNA为模板，根据植物抗线虫病基因NBS保守氨基酸序列设计引物，进行 RT-PCR分析，发现农大603的肌醇-1-磷酸合成酶(Myo inositol-1-phosphate synthase , MIPS)基因的表达量高于徐薯18。采用3'RACE技术扩增出MIPS基因的3'末端cDNA。根据植物MIPS基因 5'端一段保守的氨基酸序列设计兼并引物，并与3'端的特异引物组合，扩增出该基因的5'端cDNA序列。DNA序列比对表明，甘薯MIPS基因与大豆(Glycine max)、番茄(Lycopersicon esculentum )的MIPS基因同源性较高，分别达83.63 %和83.89 %。甘薯MIPS基因全长cDNA的克隆，有利于进一步研究该基因与抗甘薯茎线虫病的关系。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因的克隆与序列分析

从中华蜜蜂（Apis cerana cerana)和意大利蜜蜂（Apis mellifera)工蜂毒腺中快速抽提总RNA，用RT-PCR方法分别扩增各得到约含470bp的cDNA片段，将这2个片段克隆入PGEM-T载体，进行测序和序列分析，结果表明，这2个片段均含有405bp、编码蜂毒PLA2成熟肽的cDNA，并分别由cDNA推导出两者所编码的氨基酸序列，经序列比较，中蜂PLA2与意蜂PLA2具有95%的同源性，与大蜜蜂PLA2、美国熊蜂PLA2及黑腹果蝇PLA2的同源性分别为90%、54%、39%。     

高等植物基因上游可译框架（uORF）的分析

真核生物mRNA 5’非编码区上游可译框(uORF)在基因翻译水平上的调控具有重要作用。对植物2200多个cDNA序列5’非编码区的uATG和uORF进行统计分析，结果表明，含uATG的基因高达18％，这一比例比估计的10％要高得多，其中含单个uATG的基因约占50％，含2个uATG的基因占20％左右；大部分uORF属于非交叉uORF，约占85％：编码1～5氨基酸的uORF占30％以上，大部分uORF编码多肽小于20个氨基酸，占77．6％；mRNAORF起始密码子ATG的两边序列有显著的偏爱性，与植物共有序列UAAACAAUGGCU或AACAAUGGC基本一致，但有uATG的mRNA ORF起始密码子ATG的两边序列比不含uATG的mRNA ORF起始密码子ATG的两边序列偏爱性要差。大多数uATG两边序列缺乏植物ORF起始密码子ATG的两边序列的偏爱性。不同种属mRNA5’非编码区uORF氨基酸并不具有显著的同源性，如果植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶等少数基因具有非常保守的uORF，氨基酸序列同源性高达75％～100％，显著高于植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶之间的同源性。     

小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。     

甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT- PCR结合RACE技术克隆了甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）乙酰胆碱酯酶基因cDNA,Dd-ace-3,提交GenBank登录号EF583057。该cDNA序列5’端存在反式剪接引导序列SL1,全长2517bp ,包含一个1836bp的开放阅读框;在推导出的611个氨基酸残基的前体蛋白中, N 端的前21个氨基酸残基为信号肽, C-28的位置存在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点,除此之外的562个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列,其预测的分子量为64396.81D。在一级结构中,形成催化活性中心的3个氨基酸残基 (Ser232 ,Glu360 和His479) ,以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守;在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基,其中11个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。该酶的氨基酸序列与秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）ACE-3和ACE-4的同源性达56.1%和50.0%。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示,甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与Ш型乙酰胆碱酯酶ACE-3同属一个支系。     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

SON-PCR扩增抗禾谷孢囊线虫基因LRR区及序列分析

根据与抗禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)基因Cre3的NBS(nucleotide binding site)编码区高度同源的Rccn4 序列设计3条3'端嵌套引物,采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法从含有源于易变山羊草(Aegilops varibilis)的抗禾谷孢囊线虫基因的小麦(Triticum aestivum)-易变山羊草染色体小片段易位系E-10中获得了长度为1264 bp的Rccn-L(GenBank登录号为DQ124933)，它将Rccn4 3'端延伸了1209 bp,编码区长1026 bp，含一个不完整的开放阅读框,一个终止密码子，没有起始密码子和内含子结构。其编码一个342个氨基酸残基的蛋白质，含有NBS(nucleotide binding site)-LRR(leucine-rich repeats) 类抗性基因LRR区的保守模体,呈现XXLXXLXXL重复。首次将SON-PCR方法成功地运用到植物基因组学研究中，为植物基因克隆又提供一方法。     

番茄果实中LeERF1、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族，这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域。根据对番茄(Lycopersicon esculentum)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较，在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物，通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段，用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期)，得到两个基因LeERF1和LeERF2。通过BLAST工具在GenBank中搜索表明，LeERF1和LeERF2基因属于EREBP家族，LeERF1与EREBP-4和DDTFR10／A在氨基酸水平上的序列相似性为35％，LeERF2与EREBP-3和p65在氨基酸水平上的序列相似性为46％，是新的基因。LeERF1和LeERF2的核酸序列在GenBank发表，登录号分别为AY077626和AY275554。     

牦牛MT-I/Ⅲ基因cDNA 3′末端全长的克隆与序列分析

摘 要：分别利用基因特异引物YMT-ⅠSP、YMT-ⅢSP和M13 引物，通过RT-PCR和3′-RACE 方法从牦牛肝脏和大脑组织RNA中分别扩增并克隆出了牦牛MT-I / Ⅲ cDNA 3′ 端全长序列（分别为331bp和378bp），其中分别包含MT-I基因编码区全长（183bp）、MT-Ⅲ基因编码区全长（207bp），同时在MT-I / Ⅲ基因cDNA的3′ 末端具有加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。将牦牛MT-I / Ⅲ cDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现，牦牛MT-I/Ⅲ核酸序列特别是其编码区序列在不同哺乳动物中相当保守。牦牛MT-I基因编码的MT-I蛋白由61个氨基酸组成，其中20个半胱氨酸(Cys)，具有保守的三肽结构如：C-X-C，C-C-X-C-C，C-X-X-C等，在分子进化上十分保守；MT-Ⅲ编码的蛋白质由68个氨基酸组成，其中19个Cys，除了具有与MT-Ⅰ相同的以上保守的短肽结构外，牦牛MT-Ⅲ蛋白质的氨基酸序列还具有T、CPCP、GEGAEA等MT-Ⅲ蛋白质特异的保守短肽结构结构，在分子进化上亦很保守。     

山药PAL基因全长cDNA序列的克隆、表达与分析

为了阐明苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC4.3.1.5)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的分子机理,本研究运用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技术从大薯(Dioscorea alataL.)’Zixiao’地下块茎中克隆到同一个PAL基因的3个片段,即长度分别为1 145bp、1 151bp和424bp的中间片段、3’端和5’端的cDNA序列;将3段cDNA序列拼接后获得大小为2 376bp的PAL基因全长cDNA序列,该序列含有一个1986bp的最大开放阅读框(ORF),一个28bp的5’端非翻译区,一个362bp含25 nt的Poly(A+)尾的3’端非翻译区,最大ORF可推测编码一个包括PAL酶活性中心的特征序列(GTITASGDLVPLSYIA)在内的661个氨基酸的多肽,分子量为71.974kDa,等电点6.310;大薯地下块茎的PAL基因分别在核苷酸与氨基酸水平上和GenBank中所选已知其他物种的同源性为73%~77%和76%~82%,说明PAL基因在系统进化上相对保守;RT-PCR分析表明该基因仅在地下块茎中表达,而且表达丰度在收获前逐渐降低。