荔枝霜疫霉巢式PCR和LAMP检测方法的建立

由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫霉病是荔枝(Litchi chinensis)生产上的重要病害,建立霜疫霉快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控至关重要.本研究以荔枝霜疫霉三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(GTP-binding protein gene,Ypt1)为靶序列,设计特异性引物,建立了巢式PCR和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种检测方法,并进行特异性和灵敏度验证.特异性检测表明,只有不同来源的21个荔枝霜疫霉菌株经PCR扩增获得249 bp的特异性条带,同时,在钙黄绿素指示剂的作用下,LAMP检测显示绿色,且扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带,而其他13种不同卵菌近缘种及8种常见病原真菌42个菌株均未观察到这些现象.灵敏度检测显示,将特异引物PvYF1/PvYR1与疫霉属Yptl通用引物Yph1F/Yph2R进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达100fg/25 μL,较常规PCR提高1 000倍,而LAMP方法检测灵敏度是巢式PCR的10倍.本研究分别采用常规PCR、巢式PCR和LAMP方法对采集自福建省荔枝霜疫霉病典型症状及可疑症状的荔枝叶片或果实进行检测,并用传统分离方法进行验证.结果表明,在漳州采集的30份样品中,常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为17/22(77.3％)、20/22(90.9％)和21/22(95.5％);在莆田采集的25份样品中,常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为15/17(88.2％)、16/17(94.1％)、17/17(100％).可见LAMP方法明显提高了检测效率,并且具有检测程序便捷,所需设备简单和肉眼能判断结果的优势,适合基层部门及田间荔枝霜疫霉快速检测.     

薄壳山核桃幼苗对干旱胁迫的生理生化响应

为探究薄壳山核桃幼苗对干旱胁迫的适应能力,本试验以一年生薄壳山核桃幼苗为材料,采用盆栽控水试验,设置正常供水(CK)、轻度干旱胁迫(LD)、中度干旱胁迫(MD)和重度干旱胁迫(SD)4种水分处理梯度,测定相关生理生化指标并分析叶片超微结构。结果表明,在干旱胁迫50 d时,随着干旱程度加剧,叶绿素a含量呈下降趋势,CK的叶绿素a含量分别是LD和MD的1.22和1.35倍;MD叶片气孔大量闭合,关闭密度达236 个·mm^-2;LD和MD的净光合速率(Pn)较CK分别下降了17.16%和58.42%。此外,渗透调节物质含量在干旱胁迫下显著提高,其中LD和MD的可溶性蛋白含量较CK分别增加了141.68%和204.17%。在干旱胁迫50 d时,MD幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)活性达到峰值,为367.93 U·mg^-1prot,而过氧化物酶(POD)活性较干旱胁迫20 d出现下降。各水分梯度处理下,LD幼苗长势最好;MD叶片叶绿体结构破坏严重,基粒片层模糊不清;SD幼苗死亡,故为满足幼苗生长需要,应保证种植地土壤含水量达到田间持水量的35%以上。本研究结果为薄壳山核桃栽种区域的选择以及进一步扩大薄壳山核桃栽种面积提供了理论依据。     

广西霞烟鸡抗马立克氏病选育报告

鸡的马立克氏病(MD)抗病育种是防制 MD 的一个新方向。经三年多的研究,采用马立克氏病病毒(MDV)强毒株攻击霞烟鸡1日龄雏鸡,选留幸存者进行繁殖,其后代未经MD 疫苗接种,以自然感染进行选择,并结合后裔攻毒测定法进行抗 MD 的选育。至三世代时,鸡抗 MD 的能力已大为提高。三世代雏鸡1日龄攻毒后,10周龄时 MD 总保护率为74%,与对照组的35%有非常显著的差异(P<0.001),其中自然死亡鸡的 MD 肿瘤阳性率为16%,与零世代的48.1%有非常显著的差异(P<0.001).与对照组的37.5%亦有显著差异(P<0.05);1日龄经火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗免疫,14日龄以 MDV 强毒攻毒后,三世代10周龄时对 MD总保护率为96.9%,而对照组为87%。抗病核心群目前已有基本种鸡500羽。     

优质新疆拉面品种品质评价的多重PCR体系构建与应用

新疆拉面是深受人们喜爱的特色面食之一,建立优质新疆拉面品质评价体系对其专用品种选育和评价具有重要意义。本研究构建了3套检测新疆拉面优质基因的多重PCR体系,并对46份新疆冬小麦(Triticum aestivum L.)进行了检测。体系Ⅰ可同时直接检测Ax2、Pinb-D1b和ω-secalin(1B·1R易位)3种基因,体系Ⅱ可同时直接检测两个位点Psy-A1(Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-A1c)和Ppo-D1(Ppo-D1a、Ppo-D1b)的5种基因,体系Ⅲ可同时直接检测Glu-B3a、Wx-B1a和Wx-B1b3种基因,3套体系检测对照品种(系)的结果均与已知基因型完全一致。对46份新疆冬小麦的检测结果表明,Ax2、Pinb-D1b和不含ω-secalin(非1B·1R易位)基因出现的频率依次为30.4%、45.7%和78.3%,Psy-A1a、Psy-A1b、Psy-A1c、Ppo-D1a和Ppo-D1b基因的频率分别为94.5%、4.3%、2.2%、91.3%和8.7%,Glu-B3a、Wx-B1a和Wx-B1b基因的频率依次为21.7%、91.3%和8.7%;其中,与新疆拉面优质性状相关的5个基因Ppo-D1a、不含ω-secalin、Pinb-D1b、Glu-B3a和Ax2的频率明显高于全国平均水平;共检测到19种优质拉面基因的组合类型,其中含1、2、3、4和5个优质基因的组合类型依次占参试品种(系)的13.0%、32.6%、26.1%、23.9%和4.3%,没有发现同时含6或7个优质基因的品种(系),出现频率最高的优质基因组合类型为Ppo-D1a/不含ω-secalin(非1B·1R易位)、Ppo-D1a/Glu-B3a/不含ω-secalin和Ppo-D1a/Ax2/Pinb-D1b/不含ω-secalin。研究结果表明,本研究建立的3套多重PCR体系,结果稳定可靠,可作为新疆拉面品种品质性状快速评价的方法;利用本研究构建的多重PCR体系和筛选出的含优质基因(组合)的品种(系),开展小麦品质评价和分子聚合育种,将会提高新疆拉面品种评价和选育的效率。     

洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系的建立

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv.alliicola),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物.本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(B.gladioli pv.alliicola).利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件.荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性.同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性.本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段.     

乳制品中金黄色葡萄球菌PCR快速检测方法的建立

为快速检测乳制品中的金黄色葡萄球菌,本研究将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定在滤纸片上以去除PCR反应抑制因子,并以Nuc为靶基因,建立一种无需样品前增菌的PCR快速检测方法,同时确定该方法的特异性、灵敏度和实用性,并评估该方法所用试剂在冷冻保存条件下的稳定性与实用性。结果表明,该PCR快速检测方法在检测97株目标菌及83株非目标菌后未出现假阳性或假阴性结果;该方法无需增菌处理,可在4 h内完成检测,检测限为10¹ CFU·25 g^-1或10¹ CFU·25 mL^-1;该方法与传统检测方法在实际乳制品样品中金黄色葡萄球菌的检出率及活菌检测率均一致(符合率100%);此外,该检测方法所用试剂在-20℃冷冻条件下可稳定保存至少12个月。综上所述,本研究建立的PCR快速检测方法特异性强、灵敏度高,且实用性良好,能有效去除样品基质中的PCR反应抑制因子,为乳制品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了参考依据。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

玉米耐旱自交系在干旱条件下的mRNA差异表达

用16%PEG-6000对玉米耐旱自交系“81565”进行模拟干旱处理,用DD-PCR技术研究干旱与正常浇水对照的mRNA差异表达,发现3个干旱条件下差异表达的特异片段MD1、MD2和MD3。MD1和MD2在干旱条件下减量表达,MD3为干旱诱导表达。序列分析和同源性比对表明,MD1与玉米叶绿体基因组中编码参与RNA转录本Ⅱ型内含子剪切的成熟酶的matK基因有93%的相似性,MD2与极端耐旱的Sporobolus stapfianus的丝氨酸/苏氨酸2C型蛋白磷酸酶基因PP2C的相似性达99%,MD3与属天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻metacaspase基因有99%的相似性。根据各自序列相似同源基因的功能推测,MD1、MD2和MD3三个片段可能与“81565”的耐旱机制有关。     

山茶根结线虫的LAMP-LFD快速检测方法

为了提高检测效率,本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增核酸,用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测产物,建立了一种山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)的LAMP-LFD快速检测新技术.以山茶根结线虫核糖体DNA内转录间隔区(ribosomal DNA-intemal transcribed spacer,rDNA-ITS)为检测靶标,设计3对特异性引物进行生物素标记的实时荧光LAMP反应,优化后的LAMP扩增条件为63℃反应15 min.比较LFD、实时荧光曲线以及琼脂糖凝胶电泳等3种产物检测方法,结果表明,LAMP产物与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针ITS-HP杂交5 min后即可在LFD上显色,从LAMP反应开始到LFD结果判断仅需25min,比常规PCR技术缩短约2h.LAMP-LFD技术能特异性地检测山茶根结线虫,对其基因组DNA的检测灵敏度为4 pg/μL,低于常规PCR方法100倍;对其单条2龄幼虫(J2)检测灵敏度为1/1 000条线虫.本研究建立的快速、灵敏、特异性LAMP-LFD检测技术可应用于山茶根结线虫的口岸检验.     

高通量检测花生油酸含量相关基因AhFAD2等位变异的方法

花生(Arachis hypogaea)△12脂肪酸去饱和酶基因(△12 fatty acid desaturase,AhFAD2A和AhFAD2B)是决定花生籽粒油酸含量和高油酸亚油酸比值(oleic acid/linoleic acid,O/L)的关键基因,高油酸花生品种中这2个基因均发生突变.针对普通油酸花生和高油酸花生AhFAD2A 448位G/A差异和AhFAD2B 442位A碱基的插入/缺失(insertion-deletion,InDels)等位差异,已开发了包括酶切扩增多态性序列法(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)和等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等多种检测的标记和检测方法.本研究针对上述2个SNP位点,开发了可进行高通量检测的实时定量PCR引物、TaqMan 探针和检测技术,该方法检测效率和准确率均很高.本研究还开发了更为经济和高效的竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)引物和检测方法.利用开发的TaqMan探针检测方法和KASP方法检测了14个花生品种和高油酸选育回交组合BC2F1和BC1F2群体部分种子的基因型,并比较了两种方法检测结果的一致率,发现这两种方法检测AhFAD2B 442 nt A/-InDel差异结果的一致率高达96.7％;而针对AhFAD2A 448位G/A差异位点检测一致率仅为71.7％.本研究还比较了目前常用的CAPS、AS-PCR、测序法、TaqMan探针法及KASP方法的优缺点,对相关方法的应用前景进行了讨论.本研究涉及的高通量检测方法可有效地辅助高油酸品种的选育,极大地提高了目标性状选择的准确性和效率.     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

本文重组和构建了新城疫病毒 ( NDV)融合蛋白基因 ,并对该基因进行了鉴定 :将新城疫病毒 F基因片段经 RT— PCR扩增 ,插入经 Eco R I/ Sal 酶切的克隆载体 p UC18及表达载体 p GEMEX,转化大肠杆菌 JM10 9株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆 ,再用双酶切法、核酸探针、 PCR及核苷酸序列分析法鉴定 ,表明插入成功并且阅读框架正确     

PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification

A method for identification of game species has been developed on the basis of the amplification of a specific part of the mitochondrial genome (tRNA(Glu)/cytochrome b) using the polymerase chain reaction (PCR). To distinguish between several game species, the obtained 464-bp-long PCR products were cut with different restriction endonucleases (RE) resulting in species-specific restriction fragment length polymorphism (RFLP). Even closely related deer species could be distinguished by application of one or two RE. Natural polymorphisms of the target sequence within one species were examined for red deer (Cervus elaphus), and base pair substitutions were identified affecting the RFLP pattern.     

Response of Lowland and Aerobic Rice to Ammonium and Nitrate Supply During Early Growth Stages

Decreasing fresh water availability has intensified the search for alternative rice cultivation systems with reduced water input, but most evidence suggests negative effects on growth of lowland (LL) rice cultivars. Yield in such production systems may be improved by selection of adapted aerobic ‘Han Dao’ (HD) rice cultivars. Lowland and HD rice were compared under sole nitrate or ammonium supply as well as under mixed supply of both nitrogen (N) forms during the seedling and tillering stage; pronounced differences were found in response to the supplied N form. Shoot dry mass (DM) of HD was significantly lower than that of LL under sole and predominant ammonium supply, whereas LL showed the opposite trend, with significantly lower shoot DM under sole-nitrate supply. Nitrogen concentration of LL rice under sole-nitrate supply was significantly lower compared with other treatments at tillering stage. Han Dao rice had a significantly higher potassium (K) concentration than LL rice under sole-nitrate supply, while the opposite result was observed under sole-ammonium supply. At seedling stage, the portion of N that was taken up from nitrate-N varied from 30% to 40% in HD and LL rice in treatments 75N/25A and 50N/50A, while at both growth stages, predominant ammonium supply resulted in a lower portion (20%) of nitrate-derived N in LL than in HD rice. The portion of nitrate-derived N increased at tillering stage (from 40% to 70%). These results further illustrate a synergistic effect of co-provision of nitrate and ammonium on total N fluxes compared with supply of sole nitrate or sole ammonium. It was concluded that the interaction between N form and tiller formation during early growth stages deserves strong attention for the identification of aerobic rice cultivars.     

Method for analysis of tannic acid and its metabolites in biological samples: application to tannic acid metabolism in the rat

A new analytical method for measuring tannic acid (TA) using tannase was developed and applied to the investigation of TA metabolism in the rat following oral administration at a dose of 1.0 g/kg. The proposed method for TA determination was based on the enzymatic hydrolysis of TA to gallic acid (GA) and subsequent determination by HPLC. TA metabolites were determined by HPLC. 4-O-Methylgallic acid (4-OMGA), pyrogallol (PY), and resorcinol (RE) were detected in serum. TA was excreted into urine as GA (0.01%), 4-OMGA (0.10%), PY (0.24%), and RE (2.06%) and into feces as TA (62.74%), GA (0.19%), PY (0.02%), and RE (0.76%) within 54 h after oral administration. It was suggested that >60% of TA remained unchanged but that some was hydrolyzed to GA by tannase in the intestine and further metabolized to 4-OMGA, PY, and RE.     

基于REOF的淮河流域降雨侵蚀力时空变化

淮河流域作为中国重要的粮食生产基地,研究其降雨侵蚀力的时空变化特征,对流域水土流失防治、土壤资源保护及农业可持续发展具有重要意义。该研究基于淮河流域内的40个气象站点1960-2018年的日降雨数据,采用Xie方法计算各站点降雨侵蚀力及降雨侵蚀力密度;使用旋转经验正交函数（Rotating Empirical Orthogonal Function,REOF）对淮河流域依据降雨侵蚀力的分布特性进行分区,采用线性倾向率、改进的Mann-Kendall检验和R/S分析法来分析流域内降雨侵蚀力的时空变化特征;并为不同分区提供合理的农业水土流失防治措施。结果表明：1）淮河流域多年年均降雨侵蚀力及降雨侵蚀力密度分别为4 264 MJ·mm/(hm2·h)和4.21 MJ/(hm2·h),且降雨侵蚀力未来将呈增长趋势;整体上,流域内年降雨侵蚀力从东南部向西北部递减,年降雨侵蚀力密度从北部向南部递减。2）基于淮河流域40个站点的年降雨侵蚀力序列,使用REOF展开的10个空间特征向量的累计贡献率达74.34%,可着重突出空间分布特征。并依据这10个模态分布将淮河流域的降雨侵蚀力场划分为降雨特征不同的10个地理区。3）降雨侵蚀力较高的分区为第2、3、4、5和6区,主要集中于流域南部和东部;5-9月的降雨侵蚀力约占全年总和的80%～91%,降雨侵蚀力密度较高。3）在降雨侵蚀力较高的5-9月期间,流域内各区域的农业活动过程中需加强水土流失防治措施,尤其是第6区所在的区域。研究结果可为淮河流域内不同区域的耕地水土保持工作提供参考,并进一步保障流域内农业可持续发展。     

不同种植模式对坡耕地红壤团聚体中酶活性及养分含量的影响

为探究不同种植模式下坡耕地红壤团聚体中的酶活性和养分含量，为改善耕地质量提供理论依据，以坡耕地红壤为研究对象，设置大豆单作（DD）、玉米单作（MM）、大豆玉米间作（MD）、裸地（CK）4个处理，利用干筛法获得2~1、1~0.25、<0.25 mm粒径团聚体，并测定了其中的酶活性和养分含量。结果表明：①与CK、DD、MM处理相比，MD处理显著提高了2~1 mm粒径团聚体的含量，增幅分别为22.2%、13.3%、16.2%。②MD处理显著提高了2~1 mm粒径团聚体中的有机质、有效磷、碱解氮含量，分别较DD和CK处理提高11.9%、29.2%，51.1%、57.5%和16.5%、29.1%；速效钾含量均表现为DD处理显著高于CK、MM、MD处理。③与CK、DD、MM处理相比，MD处理显著提高了2~1 mm和1~0.25 mm粒径团聚体中的脲酶活性，增幅分别为61.0%、18.8%、14.5%和65.0%、17.9%、13.8%，显著提高2~1 mm粒径团聚体中的蔗糖酶活性和<0.25 mm粒径团聚体中的酸性磷酸酶活性，增幅分别为63.8%、57.1%、32.8%和80.4%、44.3%、74.1%。④冗余分析表明，2~1 mm粒径团聚体中的脲酶和蔗糖酶活性与有效磷、有机质含量显著正相关，1~0.25 mm粒径团聚体中的酶活性与有机质、有效磷、碱解氮含量显著正相关，<0.25 mm粒径团聚体中的酶活性与碱解氮、有效磷含量显著正相关。研究表明，合理的种植模式不仅可以促进大团聚体的形成，还能提高大团聚体中的酶活性和养分含量，从而提高土壤肥力，改善耕地质量。     

基于特征光谱参数的苹果叶片叶绿素含量估算

果树叶绿素含量的快速、无损、准确监测,可以及时掌握果树的营养水平,对指导果树管理具有重要意义。该文利用2012年和2013年山东省肥城市潮泉镇下寨村的苹果叶片叶绿素含量和叶片光谱数据,分析了叶绿素含量和苹果叶片原始光谱及其变换形式之间的相关性,筛选出较优光谱参数,并利用随机森林法、偏最小二乘法、BP神经网络和支持向量机回归法进行估算和验证。结果表明:1)叶绿素含量与叶片原始光谱及其变换形式之间的最优光谱参数分别为554和708 nm的原始光谱反射率,554和708 nm倒数之对数光谱,535、569、700和749 nm一阶微分光谱以及557和708 nm连续统去除光谱;2)随机森林、偏最小二乘法、BP神经网络和支持向量机估算模型的R2分别为0.94,0.61,0.66和0.60,RMSE分别为0.34,0.78,0.75和0.81 mg/dm2。说明随机森林算法模型用于估算苹果叶片叶绿素含量效果较好,为及时了解果树养分状况及果树营养诊断提供技术支持。