联合固氮遗传工程菌的田间释放与风险评价

应用遗传工程技术分别将含有ｎｉｆＡ＾ｃＤＮＡ片段的质粒及含有Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ的广泛宿主自杀性质粒ｐＳＺ３６转入了三个联合固氮菌，即粪产碱菌，阴沟肠杆菌及催娩克氏菌中；把Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ－ｎｔｒＣ转入了粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１。这些转化结合子在高铵下表现出固氮活性，并能集聚在水稻根表，而野生型菌在相同条件下远离水稻根表。这些菌株的田间释放实验在严格控制条件下进行，应用＾１５Ｎ稀释技术测定其固     

粪产碱菌与水稻根的联合过程

应用~(15)N同位素标记菌体和Tn5转座子诱变的突变株研究固氮粪产碱菌对宿主水稻的联合进程,结果表明,粘附作用是结合过程的第一步,接种3h后粘附在根表的菌体数量达最大值,约占接种量的3.7％。粘附的菌体易脱离根表,表明粘附作用是细菌与宿主植物间的弱的相互作用。在根表定位是结合过程的第二步。接种15h后,定位菌体数量达最大值,约占接种量的21％。经振荡处理不能使定位菌体脱离根表。定殖是结合过程的第三步,接种20h后定殖菌体紧密结合于根表,剧烈振荡亦不易使其脱离根表。定殖后菌体开始出现果胶酶活性。采用趋化(Che)和胞外多糖(Exo)突变株研究表明,趋化性和胞外多糖的合成是影响细菌在根表结合的重要因素。粪产碱菌在水稻根表没有专一的粘附部位,但粪产碱菌的定位和定殖主要发生在主根根表,尤其是主、侧根交接处。     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的反硝化及固氮作用

粪产碱菌生长在NH_4~+和NO_3~-两种氮源的介质中时,优先利用NH_4~+,在好气条件下,NH_4~+的存在抑制了粪产碱菌对NO_3~-的同化作用。在厌氧条件下,粪产碱菌能以乳酸为碳源,NH_4~+为唯一氮源进行反硝化作用,NO_3~-作为最终电子受体,接受无氧呼吸链传递的末端电子,经NO_2~-等氮氧化物最终还原为N_2。在好气和厌气条件下,低浓度的NO_2~-对粪产碱菌生长有一定抑制作用,但NH_4~-的存在并不抑制细菌对NO_2~-的利用。粪产碱菌在厌氧条件下还具有需硝酸盐的固氮酶活性。当氧存在或以NO_2~-代替NO_3~-时,固氮活性均受抑制,硝酸盐或亚硝酸盐浓度愈高,抑制愈强。反硝化作用产生的N_2能为微好氧条件下生长的粪产碱菌所重新固定。     

盐胁迫下粪产碱菌在水稻根表的定殖(英文)

粪产碱菌A1 5 0 1能在氯化钠浓度高达 4%的固体和液体介质中良好生长 ,合成IAA和固定空气中的氮素。当氯化钠浓度超过 3 %时 ,A1 5 0 1丧失运动和趋化能力。一定盐浓度胁迫下A1 5 0 1能定殖在水稻根表和根毛区和侧根伸出部位 ,表现出较高的联合固氮活性。0 5 %的氯化钠能促进A1 5 0 1在水稻根表的定殖能力。A1 5 0 1能通过侧根伸出部位侵入根内。     

nifH—lacZ融合基因在粪产碱菌中及联合固氮条件下的表达调节

将巴西固氮螺菌ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ转入粪产碱菌Ａ１５０１中，β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性测定结果表明，该转录型融合基因ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ在Ａ１５０１中的表达为诱导型的，在固氮条件下高水平表达，在高铵好氧下低水平表达，在无铵好氧下部分表达。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析证明在粪产碱菌中存在ｎｉｆＡ、ｒｐｏＮ和ｎｔｒＣ基因的同源序列，表明粪产碱菌ｎｉｆＨＤＫ的转录启始可能为ＮｉｆＡ和α＾５４依赖型的。携     

异源nifL在粪产碱菌的表达及功能研究

本实验采用两亲结合方法，将棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）的ｎｉｆＬ－ｌａｃＺ融合基因转入固氮粪产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｎｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ａ１５０１中获得了携带异源ｎｉＬ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５Ｌ１。对野生型和结合子的固氮活性，β－半乳糖苷酶活性及根表定殖能力的测定结果表明：（１）异源ｎｉｆＬ在粪产碱菌中的表达受Ｏ２和ＮＨ＾＋４的抑制，好氧条件下基因表达     

固氮粪产碱菌基因文库的构建及ntrC的克隆

采用广泛寄主范围的粘粒载体ｐＬＡ２９１７构建粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ的基因文库。以巴西固氮螺科菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｎｔｒＣ ＤＮＡ为探针，经菌落杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选获得含ｎｔｒＣ－ｌｉｋｅ基因的阳性克隆ｐＬＡＦ５８，建立了含ｎｔｒＣ同源序列的９．５ｋｂ ＳａｃＩ片段的物理图谱，采用巴西固氮螺菌ｎｔｒＢ ＤＮＡ探针杂交证明粪产碱菌ｎｔｒ     

固氮粪产碱菌nifH基因的亚克隆及其启动子的核苷酸序列分析

采用＾３２Ｐ标记的巴西固氮螺菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＨ ＤＮＡ探针，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ同源的ＤＮＡ序列。在不同ＮＨ４＾＋浓度下测定ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因在粪产碱菌结合子中的β－半乳糖苷酶活性，结果证明该融合基因的表达受     

重组耐铵固氮菌株的田间长期定点释放试验

以广泛分布于我国南方水稻田的固氮粪产碱菌为起始菌株，通过遗传重组手段构造了耐铵菌株Ａ１５１３和Ａ１５２３，田间累计释放面积已达万公顷以上。接种重组耐铵固氮菌株的增产幅度及田间固氮率（Ｎｄｆａ％）均高于野生型。长期定点释放试验证明：在不施肥条件下，长期施用固氮菌剂不影响土壤肥力，对土著微生物群落的生态平衡也不构成威胁。重组子所携带的抗性基因在自然条件下不能扩散，并在无选择压力下逐渐丢失。根据粪产碱菌     

固氮粪产碱菌ntrC基因的表达及固氮调节功能研究

采用双亲结合方法，将粪产碱菌Ａ１１５０ｌｎｔｒＣ和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因转入Ａ１５０１中，获得携带双拷贝ｎｔｒＣ的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ２）。在微好氧条件下，当铵为６ｍｍｏｌ时结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）仍保持３４．８％的固氮活性，表明在粪产碱菌中ｎｔｒＣ具有固氮正调节功能。在不同铵、氧、ｐＨ和盐浓度等条件下测定结合子Ａ１５０１     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）表面蛋白变构作用的研究

采用电子自旋共振技术（ＥＳＲ），以马来酰亚胺自旋标记粪产碱菌野生型（Ａ１５０１）、胞外多糖突变株（ｅｘｏ＾－和ｅｘｏ＾＋＋）及工程菌（ｎｉｆ某Ａ和ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ重组子），监测由粪产碱菌表面多肽及些膜蛋白构象变化引起的ＥＳＲ波谱的变化。结果表明，粪产碱菌野生型菌株细胞表面特性显著不同于胞外多糖突变株及工程菌，根系粘质及ＮＨ４＾＋都能引起粪产碱菌表面蛋白的构象变化，标记后菌体ＥＳＲ参数τｃ的变化与     

固氮粪产碱菌中nif,ntr和gln基因鉴定及nifA克隆

本工作采用＾３２Ｐ标记的与固氮（ｎｉｆ）和一般氮代谢（ｎｔｒ和ｇｌｎ）系统有关的基因探讨，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤＫ、ｎｔｒＡ，ｎｔｒＣ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ同源的ＤＮＡ序列。以Ａｚｏｓｐｉｒｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＡ ＤＮＡ为探针，经三轮杂交筛选。     

固氮粪产碱菌nifH∷gusA融合基因的构建及在根际联合体系中…

采用ＰＣＲ技术，获得含粪产碱菌ｎｉｆＨ基因启动子的０．６ｋｂＨｉｎｄ－Ⅲ－ＢａｍＨＩ的扩增片段，核苷酸序列分析结果表明，该ＰＣＲ产物的序列与已报道的模板ｎｉｆＨ启动子序列完全一致。通过两轮基因连接、转化和筛选，获得ｎｉｆＨ启动子与ｇｕｓＡ正向连接的融合基因表达载体ｐＴＧＹ７。经三亲结合将ｐＴＧＹ７导入粪产碱菌中，证明该融合基因能在结合子中正常表达。采用融合基因表达的组织化学定位方法，研究粪产碱菌在     

粪产碱菌耐铵工程菌与水稻联合共生固氮作用

粪产碱菌（ Ａａｅｃａｌｉｓｆａｅｃａｌｉｓ） 在ＬＷ 培养基下能产生植物激素ＩＡＡ。盆栽结果表明,接种Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 显著提高了水稻的生长,接种Ａ１５０１ 和Ａ１５１３ 的水稻稻谷产量分别比未接种提高了８５％ 和１０３ ％ ,用１５ Ｎ 同位素稀释法估测水稻地上部总氮中来源联合固氮的百分率达９００ ％ 和１１５ ％ ,其结果与水稻地上部（ 茎叶及稻谷） 总氮量的增加幅度（８６ ％ 和１１６ ％ ）基本一致。研究还表明Ａ１５１３ 耐铵工程菌的产ＩＡＡ作用以及对水稻的生长和产量、联合固氮作用均优于原始菌株Ａ１５０１ 。     

水稻根际土壤及根组织内外固氮微生物的遗传多样性分析

利用PCR—RFLP检测了水稻根际土壤及根组织内外固氮微生物的nifH基因。对54个阳性克隆的nifH 限制性内切酶Mnl I的RFLP图谱进行UPGMA聚类分析和最大似然法分析，结果表明了8对相似的带型(相似性> 50%)和2对同源性为100%的带型分别来源于水稻根际土壤及根组织内外，3种特有的带型均来源水稻根际土壤和3种特有带型来源于水稻根组织内外。证明了水稻根际土壤和水稻根组织的固氮微生物具有显著的多样性，也初步显示了土壤中某些固氮微生物能定植于水稻根内或根表。     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）胞外多糖突变株的筛选及特性

应用Ｔｎ５转座子对粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１进行诱变处理，用荧光增白剂及ＴＴＣ为标记筛选，分别获得胞外多糖缺陷型和丰富型突变株。激光共聚焦观察证实，ＥＰＳ突变株确实具有与野生型不同的表面特性，贴根试验表明，突变株贴根菌数均少于野生型，胞外多糖生成过多或过少均影响菌体与根表的有效结合。     

水稻施用耐氨固氮菌的效应研究

定位试验表明：施用耐氨固氮菌能促进水稻根系对氮素的吸收，显著增加水稻产量，耐氨固氮菌具有固氮能力，但按现行的施用量则固氮水平不足３０ｋｇ／ｈｍ＾２，在施氮水平较高的情况下，施用耐氨固氮菌能增加土壤有机质，全氮和碱解氮含量。     

水稻根际固氮量及根系不同部位的固氮活性

采用乙炔还原法测定水稻根际原状土粒的固氮活性,以3∶1的换算比例推算为田间固氮量。每季水稻根际固氮量早稻为0.4-0.45斤氮/亩/66天;晚稻为0.6-0.79斤氮/亩/72天。其中早稻80—90%的氮素在抽穗至成熟期固定,而晚稻在这段期间固定的氮素占总数的40—52%。经多次测定表明:水稻根系不同部位固氮活性的趋势是,埋入土中带根基茎段2.5厘米活性最高,根基以下3厘米根段次之,3厘米以下根段活性很低,水稻根系结合的腐生性细菌以固氮菌占优势,同时也含有少量的丁酸固氮梭菌。     

AM真菌菌丝际细菌具有固氮解磷双重功能

为了认识和理解丛枝菌根真菌(AM真菌)根外菌丝表面定殖的细菌是否同时具有固氮和解磷能力,从田间生长的玉米菌根根外菌丝表面分离鉴定了固氮菌,评价了其固氮和解磷能力。从AM真菌根外菌丝表面分离出23株可在无氮培养基中生长的细菌,分属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)下的9个不同的属(Brevundimonas、Microbacterium、Sphingomonas、Paenibacillus、Variovorax、Xenophilus、Hydrocarboniphaga、Arthrobacter和Bacillus);11株细菌具有固氮酶活性,固氮酶活性最高值为(2.97±1.32)nmol·mg~(-1)·h~(-1);12株细菌具有活化有机磷的能力,11株细菌具有溶解难溶性无机磷的能力,其中8株细菌同时具有解有机磷和难溶性无机磷能力,并且解有机磷能力高于解难溶性无机磷能力;16株细菌具有分泌IAA(吲哚乙酸)能力,IAA分泌量最高值为(688.00±19.17)mg·mL~(-1);6株细菌同时具备固氮酶活性、解有机磷、解难溶性无机磷和分泌IAA能力。上述结果表明,AM真菌根外菌丝表面定殖有多种具备固氮、解磷和促生能力的细菌,这些具有多重功能的细菌可能极大地扩展菌根途径吸收土壤养分的能力。     

氮肥减施配施菌剂对水稻生长及土壤有效养分的影响

为明确滨海盐渍型水稻土在氮肥减量施用条件下,微生物菌剂促进土壤养分释放和对水稻生长影响的机制,以盐丰47水稻为供试作物,采用盆栽试验方法,研究在氮肥减量30%条件下,化肥配施固氮螺菌和复合微生物菌剂对苗期水稻生长和土壤养分有效性的影响。结果表明:化肥配施微生物菌剂明显提高水稻生物量,增加水稻株高、根长、根体积、根表面积等根系发育指标。与常规施肥相比,在氮肥用量减少30%条件下配施微生物菌剂可以提高土壤有效磷和速效钾含量,提高幅度分别为2.71%～17.67%和0.73%～18.17%,土壤碱解氮含量变化相对较少,差异不明显。微生物菌剂可以替代部分化肥对水稻生长的促进作用,氮肥配施复合微生物菌剂处理比配施固氮螺菌的效果更好。研究结果对化肥合理减施、保障作物产量和合理应用微生物菌剂有重要意义。