绵羊多胎主效基因FecB分子检测方法的建立与应用

FecB（Fec,fecundity;B,Booroola）是在布鲁拉美利奴(Booroola Merino)绵羊（Ovis aries）中发现的能增加排卵数和产羔数的一个常染色体突变基因,是在绵羊中识别出的第1个高繁殖力主效基因。建立了绵羊多胎主效基因FecB的PCR-RFLP和PCR-SSCP检测方法,对小尾寒羊、湖羊、中国美利奴、东弗里生、杜泊、萨福克、特克塞尔、多赛特、考力代、德国肉用美利奴、南非肉用美利奴以及杂种羊共6 647只绵羊的检测结果表明,两种检测方法均能准确判型,稳定可靠性好,而且两种方法的检测结果完全一致。检测结果表明小尾寒羊和湖羊携带FecB突变（A746G）,中国美利奴、东弗里生、杜泊、萨福克、特克塞尔、多赛特、考力代、德国肉用美利奴和南非肉用美利奴绵羊都不携带该突变。     

绵羊抑制素βA基因多态性及其与产羔数关系的研究

设计7对引物,采用PCR-SSCP技术检测抑制素βA亚基(inhibin βA,INHBA)基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、特克塞尔羊和德国肉用美利奴羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊产羔数的影响。结果发现引物1-2、2-2和2-4扩增片段有多态性,其余4对引物的扩增片段均不存在多态性。引物1-2,多赛特羊只出现BB基因型,而其余4个绵羊品种则出现AA、AB和BB基因型;测序结果表明,BB型和AA型相比在INHBA基因5'端调控区第50位碱基处发生1处突变(G→A),该突变没有导致氨基酸的改变;小尾寒羊AA、AB和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异都不显著(P>0.05)。引物2-2,多赛特羊和德国肉用美利奴羊出现GG、GH和HH基因型,而其余3个绵羊品种只出现GG基因型;测序结果表明HH型和GG型相比在INHBA基因外显子2第142位碱基处发生1处突变(C→T),该突变导致了氨基酸由丝氨酸改变为亮氨酸。引物2-4,德国肉用美利奴羊只出现KK和KL基因型,而其余4个绵羊品种则出现KK、KL和LL基因型;测序结果表明LL型和KK型相比在INHBA基因外显子2第95位碱基处发生1处突变(G→A),该突变没有导致氨基酸的改变;小尾寒羊KK、KL和LL基因型之间产羔数的最小二乘均值差异均不显著(P>0.05)。研究结果初步表明,检测的INHBA基因位点对小尾寒羊高繁殖力没有显著影响。     

小尾寒羊和湖羊高繁殖力候选基因BMPR-IB的研究

以控制Booroola Merino绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊、湖羊)以及低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、萨福克羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响.结果表明高繁殖力的小尾寒羊和湖羊在BMPR-IB基因编码序列第746位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的突变(A746G),而低繁殖力的多赛特和萨福克绵羊则没有发生这种突变.小尾寒羊B等位基因频率为0.716,+等位基因频率为0.284;湖羊B等位基因频率为0.941,+等位基因频率为0.059.高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊、湖羊)与低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、萨福克羊)之间BMPR-IB基因型分布差异极显著(P＜0.001).BB基因型小尾寒羊第一胎和第二胎产羔数分别比++基因型多产0.92只(P＜0.01)和1.02只(P＜0.01).BMPR-IB基因型在几个绵羊品种之间的分布以及各种基因型绵羊的实际产羔两方面的研究结果都证明BMPR-IB基因是影响小尾寒羊和湖羊高繁殖力的一个主效基因,可以用于对绵羊产羔数的辅助选择.     

绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性分析

促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)在光周期介导的哺乳动物季节性繁殖过程中起着非常重要的作用,但在绵羊(Ovis aries)中的遗传特性与分子机制仍不明晰.本研究以筛选的绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点SNP为候选分子标记,利用多聚酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction-single strand conformation polymerase,PCR-SSCP)技术,检测该位点在繁殖特性不同的阿勒泰羊、中国美利奴羊、萨福克羊、多浪羊以及湖羊和小尾寒羊群体中的多态性.结果表明,绵羊TSHR基因在第10外显子481 bp处发生了T-C突变,为同义突变,SSCP检测出3种基因型:TT、TC和CC,T481C位点的TT基因型在常年发情的湖羊、小尾寒羊和多浪羊群体中属于优势基因型,而在季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊群体中比率最低,仅为8％;方差分析结果表明,常年发情的多浪羊、小尾寒羊和湖羊群体T481C位点的基因型频率与季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊存在极显著差异(P＜0.01).研究结果提示,绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性在常年发情与季节性繁殖绵羊群体中分布存在较大差异,该SNP可作为一个理想的分子标记应用于常年发情绵羊品种选育.     

小尾寒羊微卫星座位LSCV043与FecB基因的连锁分析

分析与FecB(Fec=fecundity,B=Booroola)基因紧密连锁的微卫星座位LSCV043在高繁殖力绵羊(OviS aries)品种(小尾寒羊)和低繁殖力绵羊品种(特克塞尔和多赛特)中的遗传多态性,同时分析了该微卫星座位与小尾寒羊FecB基因的连锁不平衡关系.高繁殖力的小尾寒羊在骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因编码序列第746位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的FecB突变(A746G),而低繁殖力的特克塞尔和多赛特绵羊则没有发生这种突变;小尾寒羊BB、B+和++基因型频率分别为0.487、0.398和0.115.微卫星座位LSCV043在3个绵羊品种365个个体中共检测到6个等位基因和13种基因型,最小等位基因为98 bp.最大等位基因为132bp;小尾寒羊(n=269)、特克塞尔(n=48)、多赛特(n=48)和BB基因型(n=131)、B+基因型(n=107)、++基因型(n=31)小尾寒羊中频率最大的等位基因分别是132、112、110、110、132和110 bp或112 bp,多态信息含量分别是0.750、0.769、0.757、0.712、0.762和0.774.连锁不平衡分析显示,小尾寒羊FecB基因B等位基因与LSCV043微卫星座位98 bp等位基因之间存在一定的连锁不平衡(D'=0.464),+等位基因与LSCV043微卫星座位104bp等位基因存在较强的连锁不平衡(D'=0.636).研究结果初步表明,LSCV043微卫星座位98bp等位基因与小尾寒羊FecB基因B等位基因之间存在一定的连锁不平衡关系,是与小尾寒羊多羔主效基因紧密连锁的一个遗传标记.     

小尾寒羊高繁殖力候选基因INHA的研究

采用PCR-SSCP技术检测抑制素α(inhibin α,INHA)基因5'调控区和外显子1在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)以及低繁殖力绵羊品种(中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。小尾寒羊、中国美利奴绵羊和考力代绵羊在INHA基因5'调控区发生了1处碱基突变(316C→T),南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变;突变纯合型(BB)和突变杂合型(AB)小尾寒羊平均产羔数分别比野生型(AA)多1.45只(P<0.01)和0.90只(P<0.01)。小尾寒羊和考力代绵羊在INHA基因外显子1中发生了1处碱基突变(877T→C),中国美利奴绵羊和南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变;突变纯合型(DD)和突变杂合型(CD)小尾寒羊平均产羔数分别比野生型(CC)多1.32只(P<0.01)和0.77只(P<0.01)。研究结果初步表明INHA基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记。     

小尾寒羊BMP4基因多态性及其与高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）基因外显子2、3和4在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊）和低繁殖力绵羊品种（中国美利奴绵羊、考力代绵羊、南非肉用美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：外显子2和4在4个绵羊品种中都不存在多态性,外显子3则都存在多态性。对于外显子3的引物,在4个绵羊品种中都检测到3种基因型(AA、AB、BB);统计结果表明：小尾寒羊、中国美利奴绵羊、考力代绵羊、南非肉用美利奴绵羊AA基因型频率分别为0.017、0.216、0.115、0.429,AB基因型频率分别为0.102、0.317、0.269、0.500,BB基因型频率分别为0.881、0.467、0.616、0.071;测序结果表明：BB型和AA型相比在BMP4基因外显子3第305位碱基处发生C→A的突变,该突变导致氨基酸由丙氨酸改变为天冬氨酸;BB型小尾寒羊平均产羔数分别比AB型和AA型多0.61只（P<0.05）和1.01只（P<0.05）。     

绵羊骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因部分3''非翻译区的多态性分析

根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3'非翻译区序列在绵羊(Ovis aries)高繁殖力品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力品种(特克塞尔和中国美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊和湖羊高繁殖力的影响.结果发现,引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性.对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型;测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变(121T→C和195T→C);湖羊AA和BB基因型频率分别为0.575和0.425,湖羊AA和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异不显著(P>0.05).研究结果初步表明,检测的BMPR-IB基因位点对小尾寒羊和湖羊高繁殖力都没有显著影响.     

GnRHR基因多态性及其与小尾寒羊高繁殖力关系的研究

设计8对引物,应用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测促性腺激素释放激素受体（gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR）基因外显子1、外显子2和外显子3在高繁殖力品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力品种（南非肉用美利奴、考力代和中国美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果发现引物P4和P7扩增片段具有多态性,其余6对引物的扩增片段都不存在多态性。对于P4扩增片段,在湖羊中检测到AA和BB基因型,在其余4个绵羊品种中只检测到AA基因型,BB型与AA型相比在外显子1有5个突变（+692G→A、+706T→A、+747T→C、+748A→T和+802T→A）,并引起氨基酸改变（Gly→Ser、Asp→Glu和Leu→Pro）。对于P7扩增片段,在小尾寒羊和湖羊中都检测到CC和DD基因型,在低繁殖力的3个绵羊品种中均只检测到CC基因型,DD型与CC型相比在外显子2有+50A→G和+101A→C两个突变,并引起氨基酸改变（Glu→Gly和Gln→Pro）;小尾寒羊CC和DD基因型频率分别为0.87和0.13,突变纯合型（DD）小尾寒羊平均产羔数比野生型（CC）多0.81只（P<0.01）。